探究植物细胞的吸水和失水

一、实验目的：
（1）学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。
（2）了解植物细胞发生渗透作用的原理。
二、实验原理：
1、原生质层的伸缩性比细胞壁的伸缩性大。
2、当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，细胞失水，原生质层收缩进而质壁分离。
3、当细胞液浓度大于外界溶液浓度时，细胞渗透吸水，使质壁分离复原。
三、实验步骤：

四、实验现象

知识点拨：

1、实验注意问题：
（1）盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。
（2）液泡含花青素，所以液泡呈紫色。
（3）先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。
（4）蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。
（5）发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。
2、质壁分离复原需要将发生质壁分离的植物细胞再置于低浓度的溶液或清水中，但如果所用外界溶液为葡萄糖、KNO，、NaCI、尿素、乙二醇等，质壁分离后因细胞主动或被动吸牧溶质微粒而使细胞液浓度增大，植物细胞会吸水引起质壁分离后的自动复原。
3、植物细胞发生质壁分离后，在原生质层和细胞壁之间充斥的液体为外界溶液（如蔗糖溶液）。
4、质壁分离过程中，外界溶液浓度大于细胞液浓度，质壁分离程度越大，植物细胞吸水能力越强；质壁分离复原过程中，外界溶液浓度小于细胞液浓度。
5、原核生物不会发生质壁分离，这要从两方面考虑。“质壁分离”的内因：要有细胞壁、大液泡和一定的细胞液浓度；“质壁分离”的外因：外界溶液的浓度>细胞液的浓度。相当多的“原核生物”虽然有细胞壁，但通常无大液泡。
知识拓展：



3、细胞发生质壁分离的判断与应用
在判断细胞是否发生质壁分离及其复原时有如下规律
(l)从细胞角度分析
①死细胞、动物细胞、原核细胞及未成熟的植物细胞不发生质壁分离现象。

②具中央大液泡的成熟植物细胞才可发生质壁分离现象。
(2)从溶液角度分析
①在一定浓度（溶质不能穿膜）的溶液中细胞只会发生质壁分离现象，不能自动复原。
②在一定浓度（溶质可穿膜）的溶液中细胞先发生质壁分离后自动复原，如甘油、尿素、乙醇、KN03等。 ③在高浓度溶液中细胞可发生质壁分离现象，但不会发生质壁分离复原。
即：

比较过氧化氢在不同条件下的分解：

1、实验原理：
鲜肝提取液中含有过氧化氢酶，过氧化氢酶和Fe³⁺都能催化H₂O₂分解放出O₂。经计算，质量分数为3.5%的FeCl₃溶液和质量分数为20%的肝脏研磨液相比，每滴FeCl₃溶液中的Fe³⁺数，大约是每滴肝脏研磨液中过氧化氢酶分子数的25万倍。
2、方法步骤：
（1）取4支洁净试管，编号，分别加入2mLH₂O₂溶液将2号试管放在90℃左右的水浴中加热，观察气泡冒出情况，与1号对照
（2）向3号、4号试管内分别滴入2滴FeCl₃溶液和2滴肝脏研磨液，观察气泡产生情况
（3）2-3min后，将点燃的卫生香分别放入3号和4号试管内液面的上方，观察复燃情况
3、实验结论：酶具有催化作用，并且催化效率要比无机催化剂Fe³⁺高得多

知识点拨：

注意事项：
1、不让H₂O₂接触皮肤，H₂O₂有一定的腐蚀性。
2、不可用同一支滴管肝脏研磨液必须是新鲜的肝脏在制成研磨液，由于酶具有高效性，若滴入的FeCl₃溶液中混有少量的过氧化氢酶，会影响实验准确性因为过氧化氢酶是蛋白质，放置过久，可受细菌作用而分解，使肝脏组织中酶分子数减少，活性降低研磨可破坏肝细胞结构，使细胞内的酶释放出来，增加酶与底物的接触面积。
3、放卫生香时，动作要快，不要插到气泡中，现象：3号试管产生气泡多，冒泡时间短，卫生香猛烈复燃，4号试管产生气泡少，冒泡时间长，卫生香几乎无变化避免卫生香因潮湿而熄灭。
4、控制变量法：变量：自变量、因变量、无关变量。
对照实验：除一个因素外，其余因素都保持不变的实验。

绿叶中色素的提取和分离：

1．原理
(1)各种色素能溶解在有机溶剂（无水乙醇等）中形成溶液，使色素从生物组织中脱离出来。
(2)各种色素都能溶解在层析液中，但在层析液中的溶解度不同。溶解度大的色素分子随层析液在滤纸上扩散得快，反之则慢，因而不同色素可以在滤纸上通过扩散分开，各种色素分子在滤纸上可形成不同的色素带。
2．实验过程
 
观察结果：滤纸条上色素带有四条，由上到下分别是胡萝卜素、黄色的叶黄素、蓝绿色的叶绿素、黄色的叶黄素、蓝绿色的叶绿素a、黄绿色的叶绿素b，
如图


实验要点及注意事项：

1、实验中几种化学药品的作用
①加入少量SiO₂，可破坏细胞结构，使研磨更充分，便于色素完全释放。
②加入少量CaCO₃，，可以中和细胞内的有机酸，防止有机酸夺取叶绿素中的镁离子使叶绿素破坏，从而起到保护色素的作用。但SiO₂.和CaCO₃的加入量要少，否则滤液杂质多、混浊、颜色浅，实验效果差。 2、实验成功的关键
①叶片要新鲜，颜色要深绿，保证色素的含量。
②研磨要迅速充分。叶绿素不稳定，易被破坏，时间过长或研磨不充分都会导致色素的量太少而使实验失败。
③滤液细线不仅要求细、直、均匀，而且要求含有较多的色素（可以重复画二至三次）。
④滤液细线不能触及层析液，否则色素溶解到层析液中，将得不到清晰的色素带。
3、注意事项
①制备滤纸条时，要剪去两角，这样可以减小边缘效应，使色素在滤纸上扩散均匀，便于观察实验结果。 ②收集滤液后，要及时用棉塞将试管口塞紧，防止滤液挥发。

4、滤纸条上的滤液细线，不能触及层析液的原因：滤纸条上的滤液细线如触及层析液，滤纸上的叶绿体色素就会溶解在层析液中，实验就会失败。
5、提取和分离叶绿体色素的关键：
（1）提取叶绿体色素的关键是：①叶片要新鲜、浓绿；②研磨要迅速、充分；③滤液收集后，要及时用棉塞将试管口塞紧，以免滤液挥发。
（2）分离叶绿体色素的关键是：①是滤液细线要细且直，而且要重复划几次；②是层析液不能没及滤液线。
6、收集到的色素滤液绿色过浅，可能原因如下：
①未加二氧化硅，研磨不充分。
②使用放置数天的菠菜叶，滤液中色素（叶绿素）太少，绿色过浅。
③一次加入大量的95%的乙醇，提取浓度太低（正确做法：分次加入少量95%的乙醇提取色素）。
④未加碳酸钙或加入过少导致色素分子被破坏。
7、如果滤纸条色素带重叠，原因可能是滤纸条上的滤液细线接触到层析液。
知识拓展：

实验创新：本实验中的长条滤纸可以改为圆形滤纸，在滤纸的中央滴一滴滤液，然后用一根浸有层析液的棉线的一端垂直接触滤液的中必位置，会得到近似同心的四个色素环，由内到外依次是黄绿色、蓝绿色、黄色、橙黄色。
例  以“叶绿体中色素的提取和分离”实验中，下列描述正确的是(  )
A．将5g新鲜完整的菠菜叶，放入研钵中，加入无水乙醇、石英砂、CaCO3以后，迅速研磨
B．用毛细吸管吸取少量滤液；沿铅笔线处小心均匀地画出一条滤液细线，并连续迅速地重复画2～3次
C．把画好细线的滤纸条插入层析液中，并不断摇晃，以求加快色素在滤纸条上的扩散
D．色素分子是有机物，不溶于水，所以研磨过程中加入无水乙醇是为了溶解色素
答案D

观察根尖分生组织细胞的有丝分裂：

一．实验目的：
（1）制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片
（2）观察植物细胞有丝分裂的过程，识别有丝分裂的不同时期，比较细胞周期不同时期的时间长短。
（3）绘制植物细胞有丝分裂简图。
二．实验原理：
（1）在高等植物体内，有丝分裂常见于根尖、芽尖等分生区细胞。由于各个细胞的分裂是独立进行的，因此在同一分生组织中可以看到处于不同分裂时期的细胞。
（2）染色体容易被碱性染料(如龙胆紫溶液)着色，通过在高倍显微镜下观察各个时期细胞内染色体（或染色质）的存在状态，就可判断这些细胞处于有丝分裂的哪个时期，进而认识有丝分裂的完整过程。
（3）细胞的分裂具有独立性：同一组织的不同细胞，在同一时间内可处于细胞周期的不同分裂时期。
三．实验步骤：
(1)洋葱根尖培养：课前3-4d，将洋葱放在盛满清水的广口瓶上，让底都接触水，放置温暖处，待根长至5cm时取用。
(2)制作临时装片 (解离→漂洗→染色→制片)

（3）观察：先用低倍镜观察，找到分生区。分生区细胞的特点是细胞呈正方形，排列紧密。然后把观察目标移到视野中央，再换高倍镜观察有丝分裂各个时期的细胞图像。

知识点拨：

1、制作好洋葱根尖有丝分裂装片的关键有以下几点：
（1）剪取洋葱根尖材料时，应该在洋葱根尖细胞一天之中分裂最活跃的时间；
（2）解离时，要将根尖细胞杀死，细胞间质被溶解，使细胞容易分离；
（3）压片时，用力的大小要适当，要使根尖被压平，细胞分散开。
2、操作要点
(1)解离：
①通过解离将细胞杀死，使细胞停留在不同的分裂时期。
②解离的目的是使组织细胞相互分离开。
③解离时间不宜过长或过短：过长会使根尖过分酥软且染色体成分被破坏；过短使根尖细胞解离不充分，不能相互分离开。
(2)漂洗：漂洗一定要彻底，防止残留的解离液继续破坏细胞，同时盐酸也影响染色和腐蚀镜头。
(3)染色：染色液的浓度和染色时间必须掌握好，应注意染色不能过深，否则镜下一片紫色，无法观察。
(4)压片：用力要恰当均匀，过重可能将组织压烂' 过轻则不能将细胞分散开。
(5)显微镜下观察的都是死细胞，不能看到细胞分裂的动态变化，若视野中找不到某一时期的细胞，可通过移动装片从邻近的区域中找。
知识拓展：

1、“酒精”在不同实验中的作用：
(1)体积分数95﹪的酒精：与质量分数15%的HCI 溶液按1:1的体积比混合作解离液，用于观察根尖分生组织细胞有丝分裂的实验。
(2)体积分数50﹪的酒精：检测生物组织中（如花生子叶切片）脂肪实验中，用于洗去苏丹Ⅲ染色剂染色后切片上的浮色。
(3)无水乙醇：叶绿体中色素提取与分离实验中用作色素提取剂。
(4)质量分数70%的酒精：常用作实验材料或消毒剂。
2、与细胞分裂有关的细胞器：

细胞器名称	细胞类型	时期	生理作用
核糖体	动物、植物	整个时期，但是主要是间期	各种蛋白质（组成染色体的蛋白质和细胞内的其他蛋白质）的合成
中心体	动物、低等植物	前期	纺锤体的形成
高尔基体	植物	末期	细胞壁的形成
线粒体	动物、植物	整个时期	提供能量

DNA的粗提取与鉴定：

一、实验原理
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
1、DNA的溶解性
（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
 
（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3、DNA的鉴定
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
1、实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液 
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3、去除滤液中的杂质 
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
4、DNA的析出与鉴定
（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
（2）取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤——以洋葱为实验材料：

1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。
洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。
2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。
3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。
此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。
4、鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。
DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较：

	2mol/LNaCl溶液	0.14mol/LNaCI溶液	溶解规律
DNA	溶解	析出
蛋白质	部分发生盐析沉淀	溶解	NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大

知识点拨：

1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶3、如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4、为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
5、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。
6、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
7、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
8、DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。
9、盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。
10、本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。
11、实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次日的是稀释 NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。