DNA重组技术的基本工具:1、基因工程的概念:
基因工程的别名 |
基因拼接技术或DNA重组技术 |
操作环境 |
生物体外 |
操作对象 |
基因 |
操作水平 |
DNA分子水平 |
基本过程 |
剪切→拼接→导入→表达 |
结果 |
人类需要的基因产物 |
2、基本工具:
(1)“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
③结果:经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
即 当限制性内切酶作用于特定的DNA时,把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况:
a、沿着中轴线切口(即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键)切开,得到的就是两个平末端;
b、在中轴线的两端切口切开,得到的就是两个黏性末端。例如:EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列,然后在G和A间切开,得到的就是两个黏性末端(之间可以根据碱基互补配对原则重组)限制酶的切口不都是一长一短的,一长一短的叫黏性末端,一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图:
(2)“分子缝合针”——DNA连接酶
种类 |
E·coli-DNA连接酶 |
T4-DNA连接酶 |
来源 |
大肠杆菌 |
T4噬菌体 |
功能特性 |
只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来 |
缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低 |
相同点 |
都缝合磷酸二酯键,如图: |
(3)“分子运输车”——载体
①载体具备的条件:能在受体细胞中复制并稳定保存;具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段插入;具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
③其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒
知识点拨:
1、限制酶识别的序列的特点:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴,两侧碱基互补对称;以为轴,两侧碱基互补对称。
2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。
3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次,共产生 4个黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性,以便于检测。
生物工程中酶的作用:1、DNA连接酶:主要是连接DNA片段之间的磷酸二酯键,起连接作用,在基因工程中起作用。
2、DNA聚合酶:主要是连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,在DNA复制中起做用。
3、限制性核酸内切酶:从DNA链的内部进行切割,分为限制性内切酶和非限制性内切酶。
4、DNA修饰酶(DNAmodification enzyme)是指对DNA分子进行修饰的酶,目前基因工程中常用的酶有:碱性磷酸酶、末端转移酶、甲基化酶。
5、反转录酶:依赖于RNA的DNA聚合酶,既可以用DNA为模板,也可以用RNA为模板进行互补链的合成。基因工程中主要功能是利用真核mRNA为模板反转录cDNA,用来建立cDNA文库,进而分离为特定蛋白质编码的基因。
限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶与解旋酶的区别:
项目种类 |
限制酶 |
DNA连接酶 |
DNA聚合酶 |
解旋酶 |
作用底物 |
DNA分子 |
DNA分子片段 |
脱氧核苷酸 |
DNA分子 |
作用部位 |
磷酸二酯键 |
磷酸二酯键 |
磷酸二酯键 |
碱基对间的氢键 |
作用结果 |
形成黏性末端或平末端 |
形成重组DNA分子 |
形成新的DNA分子 |
形成单链DNA分子 |
限制酶与DNA连接酶的关系:
动物细胞培养:
1、动物细胞的培养:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
2、动物细胞培养液的成分:葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
3、动物细胞培养液的特点:液体培养基含动物血清。
4、动物细胞培养需要满足以下条件
(1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。
(2)适宜的温度:36.5℃±0.5℃;适宜的pH:7.2~7.4。
(3)无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(4)气体环境:95%空气+5%CO
2。O
2是细胞代谢所必需的,CO
2的主要作用是维持培养液的pH。
5、动物细胞培养的过程:
取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
植物组织培养和动物细胞培养:
项目 |
植物组织培养 |
动物细胞培养 |
理论基础 |
植物细胞的全能性 |
细胞增殖 |
培养基 |
类型 |
(半)固体培养基 |
液体培养基 |
成分 |
水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂 |
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、动物血清等 |
取材 |
植物幼嫩部位或花药等 |
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织 |
过程 |
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结果 |
新的组织或植株个体,可以体现全能性 |
新的细胞系或细胞株,不形成个体,不体现全能性 |
应用 |
①植株快速繁殖 ②脱毒植株的培育 ③人工种子 ④生产药物、杀虫剂等 ⑤转基因植物的培育 |
①蛋白质坐物制品的生产 ②皮肤移植材料的培育 ③检测有毒物质 ④生理、病理、药理学研究 |
相同点 |
①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂,都是无性繁殖,都可称克隆,都不涉及减数分裂 ②均需无菌操作,需要适宜的温度、pH等条件 |
知识点拨:
1、细胞贴壁和接触抑制:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
2、动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
3、细胞株传至50代后,不能再传下去,但有部分存活的细胞一般能够传到40~50代,这种传代细胞叫做细胞株。
4、细胞株细胞的遗传物质没有发生改变。当细胞株传至50代以后又会出现“危机”,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变,而且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞成为细胞系。
知识拓展:
1、动物细胞培养技术的应用
(1)生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。
(2)利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点,可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞,以供植皮所需。
(3)培养的动物细胞用于检测有毒物质,判断某种物质的毒性。
2、用胰蛋白酶处理组织块,可使细胞分散开,这样做的目的是使细胞与组织液充分接触,这也说明了细胞间的主要物质是蛋白质。
3、当动物细胞培养超过50代后,少数细胞发生突变而持续分裂成为癌变细胞。癌细胞失去了接触抑制,可以在培养瓶中形成多层细胞。
4、动物细胞培养基成分特有的动物血清含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种成分.
5、植物组织培养最终产生新个体,体现全能性;动物细胞培养产生大量细胞,不形成新个体,故不能体现全能性。
动物细胞的核移植技术:1.原理:动物细胞核的全能性和细胞膜具一定的流动性。
2.种类:动物核移植技术可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植,前者比较容易。
3.材料
(1)供体细胞一般选优良动物的传代培养10代以内的细胞。
(2)受体细胞一般为减数第二次分裂中期的次级卵母细胞:①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质;②卵母细胞体积大,便于操作;③卵黄多,营养物质丰富。
4.过程
体细胞核移植的大致过程是:
高产奶牛(提供体细胞)进行细胞培养;同时采集卵母细胞,在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞,去核(显微操作) ;将供体细胞注入去核卵母细胞;通过电刺激使两细胞融合,供体核进入受体卵母细胞,构建重组胚胎;将胚胎移入受体(代孕)母牛体内;生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。
5、体细胞核移植技术的应用:
①加速家畜遗传改良进程,促进良畜群繁育;
②保护濒危物种,增大存活数量;
③生产珍贵的医用蛋白;
④作为异种移植的供体;
⑤用于组织器官的移植等。
知识点拨:选用去核卵(母)细胞的原因:卵(母)细胞比较大,容易操作;卵(母)细胞细胞质多,营养丰富; 细胞质不会抑制细胞核全能性的表达。
知识拓展:1、体细胞核移植技术存在的问题:克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
2、细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核,而是整个细胞,佯随着两细胞融合,体现细胞膜的结构特点:具有一定的流动性。
3、核移植时,一般先用电刺激使供受体细胞融合,再用物理或化学方法激活受体细胞,使其完成细胞分裂和发育进程。
4、克隆动物的性状与核供体生物的性状基本相同,而不是完全相同,因为克隆动物的细胞质遗传物质来自于受体卵母细胞;生物的性状不仅与遗传物质有关,还受环境的影响。
5、克隆属于无性繁殖,产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。
胚胎工程的应用及前景:
1、胚胎移植
(1)概念:是指将雌性动物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内,使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”。
(2)基本程序主要包括:
①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。
②配种或人工授精。
③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入-196℃的液氮中保存。
④对胚胎进行移植。
⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。
(3)胚胎移植的意义:大大缩短了供体本身的繁殖周期,充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。
(4)胚胎移植的生理学基础:
①动物发情排卵后,同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。
②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。
③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。
④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。
2、胚胎分割
(1)概念:是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
(2)材料:发育良好,形态正常的桑椹胚或囊胚。(桑椹胚至囊胚的发育过程中,细胞开始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割)
(3)理论基础:细胞的全能性。
(4)所用仪器设备:实体显微镜和显微操作仪。
(5)操作过程:选择发育良好、形态正常的桑椹胚或囊胚,移人盛有操作液的培养皿中,然后用分割针或分割刀进行分割。
(6) 意义:加快繁殖速度。
3、胚胎干细胞
(1)哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞,来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
(2)具有胚胎细胞的特性,在形态上表现为体积小,细胞核大,核仁明显;在功能上,具有发育的全能性,可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外,在体外培养的条件下,可以增殖而不发生分化,可进行冷冻保存,也可进行遗传改造。
(3)胚胎干细胞的主要用途是:
①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律;
②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料,在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段;
③可以用于治疗人类的某些顽疾,如帕金森综合症、少年糖尿病等;
④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能;
⑤随着组织工程技术的发展,通过ES细胞体外诱导分化,定向培育出人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。
知识点拨:
1、供体为优良品种,作为受体的雌性动物应为常见或存量大的且身体健康有良好的生育能力的品种。
2、地位:如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必须经过胚胎移植技术才能获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”。
3、胚胎分割要求:对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。
4、来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质,属于无性繁殖。
5、实质:是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转换,而胚胎本身的遗传物质并不发生改变,因此各种性状能保持其原来的优良特性。
6、优势:充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力,从而大大缩短了供体本身的繁殖周期,大大推动了畜牧业的发展。