多聚酶链式反应扩增DNA片段：

1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸

过程	说明	图解
变性	当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链
复性	温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸	72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸

3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2ⁿ的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。


细胞被DNA复制与PCR技术的比较：

		细胞内DNA复制	体外DNA扩增（PCR）
不同点	解旋	在解旋酶作用下边解旋边复制	80～100℃高温解旋，双链完全分开
	酶	DNA解旋酶、DNA聚合酶	TaqDNA聚合酶
	引物	RNA	DNA、RNA
	温度	体内温和条件	高温
相同点		①需提供DNA模板 ②四种脱氧核苷酸为原料 ③子链延伸的方向都是从5'端到3'端

知识点拨：

1、DNA分子复制的人工控制
解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。
恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。
复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。
2、PCR的含义是多聚酶链式反应。
3、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境；②DNA模板；③合成引物；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备
4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。
知识拓展：

1、DNA含量的测定——分光光度法

项目		说明
原理		DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰，峰值大小与DNA的含量是正相关
过程	稀释	2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释
	对照调零	以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的赌注调节至零
	测量	取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值
	计算	DNA含量（μg/mL）=50×（260nm的读数）×稀释倍数

2、DNA聚合酶不恩能够从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。

DNA重组技术的基本工具：

1、基因工程的概念：

基因工程的别名	基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境	生物体外
操作对象	基因
操作水平	DNA分子水平
基本过程	剪切→拼接→导入→表达
结果	人类需要的基因产物

2、基本工具：
（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
即 当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：
a、沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；
b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图：


（2）“分子缝合针”——DNA连接酶

种类	E·coli-DNA连接酶	T4-DNA连接酶
来源	大肠杆菌	T4噬菌体
功能特性	只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来	缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低
相同点	都缝合磷酸二酯键，如图：

 
（3）“分子运输车”——载体
①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒

知识点拨：

1、限制酶识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。

2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4个黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取
（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。
（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：

①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
（3）基因表达载体的构建过程：

3、将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用的转化方法：

生物种类	植物细胞	动物细胞	微生物细胞
常用方法	农杆菌转化法	显微注射技术	Ca2+处理法
受体细胞	体细胞	受精卵	原核细胞
转化过程	将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达	将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物	Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

知识点拨：

1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。
3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。
4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。
6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。
知识拓展：

1、基因文库的构建：
（1）概念
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。
②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。
（2）构建过程

基因组文库的构建	cDNA文库的构建

2、人工合成目的基因
（1）反转录法：

（2）人工合成目的基因

3、PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制
②过程：
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

动物细胞的融合：

1、动物细胞融合：两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。
2、诱导方法：化学法（聚乙二醇），灭活的病毒，物理法（离心、振动、电激等）。
3、动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。

动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

细胞工程	植物体细胞杂交	动物细胞融合
理论基础	细胞的全能性、细胞膜的流动性	细胞增殖、细胞膜的流动性
融合前处理	酶解法去除细胞壁 （纤维素酶、果胶酶）	注射特定抗原，免疫处理正常小鼠
诱导手段	物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇（PEG）	物理法：离心、振动、电激 化学法：聚乙二醇 生物法：灭活的病毒（灭活的仙台病毒）
诱导过程	第一步：原生质体的制备（酶解法） 第二步：原生质体融合（物、化法） 第三步：杂种细胞的筛选和培养 第四步：杂种植株的诱导与鉴定	正常小鼠免疫处理动物细胞的融合 （物、化、生法）杂交瘤细胞的筛 选与培养专一抗体检验阳性细胞培 养单克隆抗体的提纯
用途和意义	克服远缘杂交的不亲和障碍， 大大扩展杂交的亲本组合范围 应用：白菜——甘蓝等杂种植株	（1）制备单克隆抗体 （2）诊断、治疗、预防疾病，例如“生物导弹”治疗癌症

知识点拨：

动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。
知识拓展：

1、在诱导剂的作用下进行细胞的诱导融合，形成的杂种细胞有三种：AA型、BB型、AB型。只有AB型才是我们所需要的杂种细胞，所以需要用选择性培养基进行筛选。
2、相比较植物体细胞杂交，动物细胞融合特有的诱导方式是用灭活的病毒处理，其他物理化学诱导融合的方法与植物体细胞杂交过程中原生质体融合方法相同。

单克隆抗体：

1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备
（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞
（2）获得杂交瘤细胞
①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；
②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测
（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取
3、单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。


血清抗体与单克隆抗体的比较：

名称	产生	特点
血清抗体	由B淋巴	一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体	由杂交瘤细胞分泌	特异性强，灵敏度高，能大量制备

知识点拨：

1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：

制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。