酶的作用和本质：

1．酶的作用：降低活化能。
(1)活化能：分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需要的能量。
(2)作用机理：酶能降低化学反应所需的活化能，使一个原本在较温和条件下不能进行的反应可以高效快速地进行。
2．酶的本质及实验验证
(1)酶本质的探索

时间	发现者	实验过程及现象	实验结论
1773年	意大利科学家斯帕兰札尼	将装有肉块的小金属笼子让鹰吞下，一段时间后取出，发现笼内的肉块不见了	说明胃具有化学性消化的作用
1836年	德国科学家施旺	从胃液中提取出了消化蛋白质的物质	这就是胃蛋白酶
1926年	美国科学家萨姆纳	从刀豆种子中提取出脲酶的结晶，并进行了证明脲酶是蛋白质的化学实验	证明脲酶是一种蛋白质
20世纪30年代	许多科学家	提取多种酶的蛋白质结晶	酶是一类具有生物催化作用的蛋白质
20世纪 80年代	美国科学家切赫和奥特曼	少数RNA也具有生物催化功能	少数的酶是RNA

(2)酶的本质

化学本质	绝大多数是蛋白质	少数是RNA
合成原料	氨基酸	核糖核苷酸
合成场所	核糖体	细胞核（真核生物）（主要）
来源	一般来说，活细胞都能产生酶

(3)酶化学本质的实验验证
①证明某种酶是蛋白质
实验组：待测酶液+双缩脲试剂一—是否出现紫色反应。
对照组：标准蛋白质溶液+双缩脲试剂——出现紫色反应。
②证明某种酶是RNA
实验组：待测酶液+吡罗红染液——是否呈现红色。
对照组：标准RNA溶液+吡罗红染液——出现红色。
酶的特性及应用：

1、酶的特性
(1)高效性：酶的催化效率是无机催化剂的107~ 103倍，这说明酶具有高效性的特点。
(2)专一性：每一种酶只能催化一种化合物或一类化合物的化学反应，这说明酶的催化作用具有专一性的特点，酶的专一性的解释常用“锁和钥匙学说”。
(3)温和性：绝高温都能使蛋白质其他化学键的断裂永久失活。但低温酶活性可以恢复。
2、酶的特性在生产生活中的应用
（1）人在发烧时，不想吃东西，其原因是温度过高导致消化酶的活性降低。
（2）唾液淀粉酶随食物进入胃内，不能继续将淀粉分解为麦芽糖。原因是唾液淀粉酶的最适pH在7左
（3）胰岛素制剂是治疗糖尿病的有效药物，只能注射，不能口服，其原因是胰岛素是一种蛋白质，若口服会被蛋白酶水解。

1、酶的作用和特性的实验探究：

1．酶的催化作用实验探究对照组：反应物+清水检测反应物不被分解；实验组：反应物+等量的相应酶溶液检测反应物被分解。
2．酶的专一性实验搽究此实验中的自变量可以是不同反应物，也可以是不同酶溶液，因变量是反应物是否被分解。
(1)设计思路一：换反应物不换酶
实验组：反应物+相应酶溶液检测反应物被分解；
对照组：另一反应物+等量相同酶溶液检测反应物不被分解。
(2)设计思路二：换酶不换反应物
实验组：反应物+相应酶溶液检测反应物被分解；
对照组：相同反应物+等量另一种酶溶液检测反应物不被分解。
3．酶的高效性实验探究
对照组：反应物+无机催化剂检测底物分解速率；
实验组：反应物+等量酶溶液检测底物分解速率。
实验中自变量是无机催化剂和酶，因变量是底物分解速率。
4．酶作用的适宜条件的探究
(1)最适温度的探究实验原理
①淀粉+淀粉酶——麦芽糖；麦芽糖+斐林试剂—一产生砖红色沉淀；淀粉+碘——蓝色。
②温度影响淀粉酶活性，从而影响淀粉的分解，滴加碘液后，根据蓝色深浅来判断淀粉分解状况，进而推断出酶活性变化。
(2)最适pH的探究实验原理
①2H₂0₂+过氧化氢酶——2H₂O+O₂
②pH影响酶的活性，从而影响氧气的生成速度，可用点燃但无火焰的卫生香燃烧的情况来检验氧气生成速度的快慢。
(3)实验探究思路
①最适温度的探究思路

②最适pH的探究思路

2、易错点拨：

（1）在酶的最适pH探究实验中，操作时必须先将酶置于不同环境条件下（加清水、加氢氧化钠、加盐酸），然后再加入反应物。不能把酶加入反应物在酶的作用下先发生水解。
（2）在酶的最适温度探究实验中，酶溶液和反应物混合之前，需要把两者先分别放在各自所需温度下保温一段时间。若选择淀粉和淀粉酶来探究酶的最适温度，检测的试剂宜先用碘液，不应该选用斐林试剂。因选用斐林试剂需热水浴加热，而该实验中需严格控制温度。

知识拓展：

1、利用酶的专一性也可探究某种酶的化学本质是蛋白质还是RNA：将某种酶用蛋白酶或核糖核酸酶处理，根据处理后的酶液是否还有催化作用予以判断。
2、一般情况下，加热也能加快化学反应速率，其作用机理是直接供能，使底物分子从常态转变为易发生反应的活跃状态，其过程并不改变活化能的大小。
3、人体消化道各段消化酶的最适pH：
口腔：唾液淀粉酶，最适pH为6.8（中性）；
胃：胃蛋白酶，最适pH为1.5-2.2（酸性）；
小肠：肠液、胰液中的各种酶，最适pH为8.0～9.0（弱碱性）。
胃液的pH在2左右，唾液淀粉酶在胃中会使失活并以蛋白质的形式被胃蛋白酶水解
4、植物体内的酶最适pH大多在4.5-6.5之间。

例   下列有关酶的反应与作用叙述，正确的是 (  )
A．酶具有催化作用是因为酶可以提高反应的活化能
B．酶的合成原料是氨基酸或脱氧核苷酸
C．所有的酶都在核糖体上合成
D．所有的酶都是有机物
答案D

5、具有专一性的物质归纳

（1）酶：每一种酶只能催化一种或一类化学反应。如限制性核酸内切酶能识别特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。
（2）载体：某些物质通过细胞膜时需要载体协助，不同物质所需载体不同，载体的专一性是细胞膜选择透过性的基础。
（3）激素：激素特异性地作用于靶细胞、靶器官，其原因在于它的靶细胞膜或胞内存在与该激素特异性结合的受体。
（4）tRNA：tRNA有61种，每种tRNA只能识别并转运一种氨基酸。
（5）抗体：一种抗体只能与相应的抗原发生特异性结合。

腐乳的制作：

1、实验原理：
（1）参与豆腐发酵的微生物有青霉、酵母、曲霉、毛霉等多种，其中起主要作用的是毛霉。
（2）毛霉是一种丝状真菌，常见于土壤、水果、蔬菜、谷物上，具有发达的白色菌丝。
（3）毛酶等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
2、实验步骤
（1）将豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干块。所用豆腐的含水量为70%左右，水分过多则腐乳不易成形。
（2）将豆腐块平放在铺有干粽叶的盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到保温的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，以免湿度太高，不利于毛霉的生长。
（3）将平盘放入温度保持在15～18℃的地方。毛霉逐渐生长，大约5d后豆腐表面丛生着直立菌丝。
（4）当毛霉生长旺盛，并呈淡黄色时，去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，使豆腐块的热量和水分能够迅速散失，同时散去霉味。这一过程一般持续36h以上。
（5）当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。
（6）长满毛霉的豆腐块（以下称毛坯）与盐的质量分数比为5：1。将培养毛坯时靠近平盘没长直立菌丝的一面统一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层盘立摆放在容器中。分层加盐，并随层加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，以防止杂菌从瓶口进入。约腌制8d。
（7）将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料（如胡椒、花椒、八角茴香、桂皮、姜、辣椒等）混合制成卤汤。卤汤酒精含量控制在12%左右为宜。
（8）将广口玻璃瓶刷干净后，用高压锅在100℃蒸汽灭菌30min。将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般六个月可以成熟。

知识点拨：

1、用盐腌制时，注意盐都用量。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。
2、酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。
3、在豆腐乳的腌制过程中，盐的作用：盐不仅能防止豆腐腐败，还可与分解形成的氨基酸结合成氨基酸钠，使豆腐乳味道鲜美。
4、豆腐乳的前、后期制作中温度和空气条件：豆腐乳的前期制作温度控制在15℃～18℃环境条件下，因为毛霉属需氧型微生物，因而放置在空气中即可；豆腐乳的后期制作温度控制在30℃条件下，且要放入坛中密封坛口。
5、在豆腐乳的后期制作过程中，能防止杂菌生长，利于后期成熟的因素：腌制中的盐，卤汤中的酒、香辛料以及对坛子消毒、装坛密封时用酒精灯火焰处理坛口等，都有抑制微生物生长的作用。
6、影响腐乳品质的因素
(1)盐：长满毛霉的豆腐块（毛坯）与盐的质量分数比为5:1，盐的浓度过高，影响口味，浓度过低，不足以抑制微生物生长，腐乳易腐败变质。
(2)酒：配制制作腐乳所需的卤汤要加适量的酒（12%左右），其目的是抑制微生物生长，酒精过少达不到目的，过多会抑制酶的活性，影响腐乳的成熟，同时影响腐乳的风味。
(3)香辛料：具有调味和杀菌的作用，从而影响腐乳的风味或质量。
(4)发酵的温度：前期发酵温度应保持在15- 18℃，并保持一定的时间，利于毛霉生长。
知识拓展：

1、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵所发生的主要变化是毛霉在豆腐（白坯）上的生长。发酵的温度为15～18 ℃，此温度不适于细菌、酵母菌和曲霉的生长，而适于毛霉慢慢生长。毛霉生长大约5 d后使白坯变成毛坯。前期发酵的作用，一是使豆腐表面有一层菌膜包住，形成腐乳的“体”；二是毛霉分泌以蛋白酶为主的各种酶，有利于豆腐所含有的蛋白质水解为各种氨基酸。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料（红曲、面曲、酒酿），使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。
2、毛霉是一种低等丝状真菌，有多个细胞核，进行无性繁殖。毛霉是食品加工业中的重要微生物，它可以产生能够分解大豆蛋白的蛋白酶，常用于制作腐乳和豆豉。

微生物的实验室培养：

1．培养基的概念、种类及营养构成
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。

(3)营养构成：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
2．无菌技术
(1)关键：防止外来杂菌的入侵。
(2)具体操作
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。
(3)消毒和灭菌

	消毒	灭菌
概念	使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包芽孢和孢子）	使用强烈的理化因素杀死物体内外所用的微生物（包括芽孢和孢子）
常用方法	煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法	灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌
适用对象	操作空间、某些液体、双手等	接种环、接种针、玻璃器皿、培养基等

3、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。
4、接种方法：平板划线法和稀释涂布法。
（1）平板划线操作：
①挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
②划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯（这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定）。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
③划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区（菌源区）将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
④等平板凝固后，将平板倒置。
（2）稀释涂布法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。能够测定样品中活菌数的方法是：稀释涂布平板法。

纯化大肠杆菌的无菌操作和菌种保存：

1．大肠杆菌
(1)特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
(2)用途：是基因工程技术中被广泛采用的工具。
2．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
(1)计算：依据是培养基配方的比例。
(2)称量：牛肉膏比较黏稠，可同称量纸一块称取。牛肉膏和蛋白胨易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。
(3)溶化：牛肉膏和称量纸+水加热取出称量纸→加蛋白胨和氯化钠→加琼脂（注意：要不断用玻璃棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂）→补加蒸馏水至100mL。

3.纯化大肠杆菌
（1）方法
①平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
②稀释涂布平板法：将骏业进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
（2）鉴定：将接种后的培养基和一个未接种的培养基（对照组）都放入到37℃恒温箱中，培养12h和24h后，分别观察并记录结果。
（3）菌种保存

	临时保存法	甘油管藏法
适用对象	频繁使用的菌种	长期保存的菌种
培养及类型	固体斜面培养基	液体培养基
温度	4℃	-20℃
方法	菌落长成后于冰箱中保存，每3～6个月将菌种从旧的培养基转移到新鲜培养基上	将培养的菌液与等体积灭菌后的甘油混合均匀后于冷冻箱内保存
缺点	菌种易被污染或产生变异

知识点拨：

1、无菌技术操作原则：
（1）操作前准备：
①操作环境应清洁、宽敞、定期消毒；物品布局合理；无菌操作前半小时应停止清扫工作、减少走动、避免尘土飞扬。
②工作人员应做好个人准备，戴好帽子、口罩，修剪指甲并洗手，必要时穿无菌衣、带无菌手套。
（2）操作中保持无菌
①工作人员应面向无菌区，手臂应保持在腰部或操作台台面以上，不可跨越无菌区避免面对无菌区谈笑、咳嗽、打喷嚏。
②用无菌持物镊取用物品；无菌物品一经取出，即使未用，也不可放回无菌容器内；一套无菌物品仅供一位患者使用，避免交叉感染。 ③无菌操作中，无菌物品疑有污染或已被污染，应予更换并重新灭菌。
（3）无菌物品保管：
①无菌物品必须与非无菌物品分开放置。
②无菌物品不可暴露于空气中，应存放于无菌包或无菌容器中，无菌包外须标明物品名称、灭菌日期，并按失效期先后顺序排放。
③定期检查无菌物品的灭菌日期及保存情况。无菌包在未被污染的情况下保存期一般为7天，过期或受潮应重新灭菌。
2、划线分离操作中的有关问题：
（1）在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环，在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环。

	第一次灼烧	每次划线之前灼烧	划线结束灼烧
目的	避免接种环上可能存在的微生物污染培养基	杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种	杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染或感染操作者

②在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高，杀死菌种。
③在进行第二次以及其后的划线操作时'要从上一次划线的末端开始划线。每次划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(2)进行恒温培养时，要将培养皿倒置的原因如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培 养基表面并且扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则茵落中的细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此恒温培养时，培养皿必须倒置。
(3)培养后判断是否有杂菌污染的方法
①从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等等，是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。
②用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标。

知识拓展：

1、对异养微生物来说，含C、N的化合物既是碳源，也是氮源，即有些化合物作为营养要素成分时并不是起单一方面的作用。
2、并不是所有微生物都需添加特殊营养物质，有些微生物需添加，原因是它们自身缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
3、含抗生素的牛奶不能发酵为酸奶的原因：牛奶发酵成酸奶是利用乳酸菌来完成的，乳酸菌属于细菌，
4、化学药剂的消毒方法，其作用原理是使细菌体内蛋白质变性，但是化学物质很难透过孢子或芽孢的坚硬外层进入细胞内，因此化学方法难以消灭孢子和芽孢。
5、体积分数为70%的乙醇杀菌效果最强，浓度过低，杀菌力弱，浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固形，成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其内，因此杀菌效果受影响。
6、倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞（也可将试管塞或瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果试管内或三角瓶内的培养基一次用完，管塞或瓶塞则不必夹在手中）。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速例入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
7、在斜面培养基上接种时，其正确的操作顺序：
①用左手大拇指、食指和无名指夹住菌种试管和待接种的斜面试管，管口并齐，使斜面向上成水平状态
②右手拧松棉塞，但不取下
③右手拿接种环，在火焰上灼烧灭菌
④在火焰边用右手无名指和小指夹两个棉塞，将它们取下，同时左腕转动，灼烧管口一周
⑤将接种环伸入管内，让环先接触培养基上未长菌的部位，使环冷却，然后轻轻挑取少量菌体
⑥在火焰旁边迅速将沾有菌体的接种环伸到培养基的底部，由里向外轻轻画蛇形细线
⑦抽出接种环，再用火焰灼烧管口，并在火焰上方将棉塞塞上
8、自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别在于碳源。
9、平菇培养的操作程序：配制棉籽壳培养基，高压蒸汽灭菌，接种，培养。
10、菌种的保存：对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法；临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上；临时保藏的菌种容易被污染或产生变异；在临时保藏过程中，每3～6个月都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上；