基因工程的基本操作程序:1、目的基因的获取
(1)目的基因是指: 编码蛋白质的结构基因。
(2)获取方法:①从基因文库中获取;②人工合成(反转录法和化学合成法);③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建
(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图:
①启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
②终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。
③标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
(3)基因表达载体的构建过程:
3、将目的基因导入受体细胞
(1)转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)常用的转化方法:
生物种类 |
植物细胞 |
动物细胞 |
微生物细胞 |
常用方法 |
农杆菌转化法 |
显微注射技术 |
Ca2+处理法 |
受体细胞 |
体细胞 |
受精卵 |
原核细胞 |
转化过程 |
将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 |
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 |
Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 |
(3)重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达
(1)首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。
(2)其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
(4)有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
知识点拨:
1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下,便于获得所需的目的基因。
2、PCR技术:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法,也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的:通过指数式扩增获取大量的目的基因。
3、基因文库中不是直接保管相应基因,基因文库中的基因保存在受体菌中。
4、在基因工程的四个操作步骤中,只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对,其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,有利于目的基因的复制与表达,因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。
6、植物细胞的全能性较高,可经植物组织培养过程成为完整植物体,因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中,从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象,从其变化的实质看,这种变异属于可遗传变异中的基因重组。
知识拓展:
1、基因文库的构建:
(1)概念
①基因组文库:含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因组文库。
②cDNA文库:只包含了一种生物的部分基因。
(2)构建过程
基因组文库的构建 |
cDNA文库的构建 |
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2、人工合成目的基因
(1)反转录法:
(2)人工合成目的基因
3、PCR技术扩增目的基因
①原理:DNA双链复制
②过程:
第一步:加热至90~95℃DNA解链;
第二步:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;
第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
基因工程的应用:1、植物基因工程:
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外源基因类型及举例 |
成果举例 |
抗虫转基因植物 |
抗虫基因:Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因 |
抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米 |
抗病转基因植物 |
(1)抗病毒基因:病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因(2)抗真菌基因:几丁质酶基因、抗毒素合成基因 |
抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒 |
抗逆转基因植物 |
抗逆基因:调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 |
抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米 |
改良品质的转基因植物 |
优良性状基因:提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因 |
高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛 |
2、动物基因工程:
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外源基因类型及举例 |
成果举例 |
提高生长速度的转基因动物 |
外源生长激素基因 |
转基因绵羊、转基因鲤鱼 |
改善畜产品品质的转基因动物 |
肠乳糖酶基因 |
乳汁中含乳糖较少的转基因牛 |
生产药物的转基因动物 |
药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子 |
乳腺生物反应器 |
作器官移植供体的转基因动物 |
外源的抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因 |
无免疫排斥的转基因猪 |
3、基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断:DNA分子杂交法(即DNA探针法),该方法是根据碱基互补配对原则,把互补的双链 DNA解开,把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记,之后同被检测的DNA 中的同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。
(2)基因治疗的方法:基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。
(3)基因治疗的途径
①体外基因治疗:先从病人体内获得某种细胞进行培养,然后在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩增培养,最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。
②体内基因治疗:用基因工程的方法,直接向人体
知识拓展:
1、Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性,进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
2、青霉素是谤变后的高产青霉菌产生的,不是通过基因工程改造的工程菌产生的。
3、动物基因工程的应用主要体现在提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物等方面。 4、动物基因工程主要为了改善畜产品的品质,不是为了产生体型巨大的个体。
5、乳腺生物反应器产量高、质量好、成本低、易提取,在高价值蛋白质的生产上比工厂化生产更具有优越性二。
6、用基因工程的方法,使外源基因得以高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。
7、基因诊断是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。基因治疗指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
8、基因工程与环境保护
亲子鉴定:利用医学、生物学和遗传学的理论和技术,从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点,分析遗传特征,判断父母与子女之间是否是亲生关系。
使用国产制剂进行亲子鉴定
鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定,十分方便。
利用DNA进行亲子鉴定,只要作十几至几十个DNA位点作检测,如果全部一样,就可以确定亲子关系,如果有3个以上的位点不同,则可排除亲子关系,有一两个位点不同,则应考虑基因突变的可能,加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定,否定亲子关系的准确率几近100%,肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。
9、基因芯片的基本原理:就是最基本的DNA分子杂交,利用基因芯片检测某种基因时,先将待测样品制成荧光标记的DNA探针,让它与基因芯片上已知序列的DNA片段杂交,杂交信号经放大后输入计算机进行统计分析,这样就可以检测出样品DNA序列。
用途:用来检测基因表达的变化、分析基因序列、寻找新的基因和新的药物分子。利用基因芯片,可以比较同一物种不同个体或物种之间,以及同一个体在不同生长发育阶段、正常和疾病状态下基因表达的差异,寻找和发现新的基因,研究基因的功能以及生物体在进化、发育、遗传等过程中的规律。
动物细胞培养:
1、动物细胞的培养:动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖。
2、动物细胞培养液的成分:葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。
3、动物细胞培养液的特点:液体培养基含动物血清。
4、动物细胞培养需要满足以下条件
(1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。
(2)适宜的温度:36.5℃±0.5℃;适宜的pH:7.2~7.4。
(3)无菌、无毒的环境:培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染。此外,应定期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。
(4)气体环境:95%空气+5%CO
2。O
2是细胞代谢所必需的,CO
2的主要作用是维持培养液的pH。
5、动物细胞培养的过程:
取动物组织块(动物胚胎或幼龄动物的器官或组织)→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。
植物组织培养和动物细胞培养:
项目 |
植物组织培养 |
动物细胞培养 |
理论基础 |
植物细胞的全能性 |
细胞增殖 |
培养基 |
类型 |
(半)固体培养基 |
液体培养基 |
成分 |
水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂 |
葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、动物血清等 |
取材 |
植物幼嫩部位或花药等 |
动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织 |
过程 |
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结果 |
新的组织或植株个体,可以体现全能性 |
新的细胞系或细胞株,不形成个体,不体现全能性 |
应用 |
①植株快速繁殖 ②脱毒植株的培育 ③人工种子 ④生产药物、杀虫剂等 ⑤转基因植物的培育 |
①蛋白质坐物制品的生产 ②皮肤移植材料的培育 ③检测有毒物质 ④生理、病理、药理学研究 |
相同点 |
①两技术手段培养过程中都进行有丝分裂,都是无性繁殖,都可称克隆,都不涉及减数分裂 ②均需无菌操作,需要适宜的温度、pH等条件 |
知识点拨:
1、细胞贴壁和接触抑制:悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁。细胞数目不断增多,当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制。
2、动物细胞培养技术的应用:制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。
3、细胞株传至50代后,不能再传下去,但有部分存活的细胞一般能够传到40~50代,这种传代细胞叫做细胞株。
4、细胞株细胞的遗传物质没有发生改变。当细胞株传至50代以后又会出现“危机”,不能再传下去。但是有部分细胞的遗传物质发生了改变,而且带有癌变的特点,有可能在培养条件下无限制地传代下去,这种传代细胞成为细胞系。
知识拓展:
1、动物细胞培养技术的应用
(1)生产病毒疫苗、单克隆抗体、干扰素等。
(2)利用动物细胞培养技术中的细胞贴壁生长和接触抑制的特点,可用烧伤病人自己的健康皮肤细胞培养出大量的自身薄层皮肤细胞,以供植皮所需。
(3)培养的动物细胞用于检测有毒物质,判断某种物质的毒性。
2、用胰蛋白酶处理组织块,可使细胞分散开,这样做的目的是使细胞与组织液充分接触,这也说明了细胞间的主要物质是蛋白质。
3、当动物细胞培养超过50代后,少数细胞发生突变而持续分裂成为癌变细胞。癌细胞失去了接触抑制,可以在培养瓶中形成多层细胞。
4、动物细胞培养基成分特有的动物血清含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种成分.
5、植物组织培养最终产生新个体,体现全能性;动物细胞培养产生大量细胞,不形成新个体,故不能体现全能性。