DNA重组技术的基本工具：

1、基因工程的概念：

基因工程的别名	基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境	生物体外
操作对象	基因
操作水平	DNA分子水平
基本过程	剪切→拼接→导入→表达
结果	人类需要的基因产物

2、基本工具：
（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
即 当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：
a、沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；
b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图：


（2）“分子缝合针”——DNA连接酶

种类	E·coli-DNA连接酶	T4-DNA连接酶
来源	大肠杆菌	T4噬菌体
功能特性	只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来	缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低
相同点	都缝合磷酸二酯键，如图：

 
（3）“分子运输车”——载体
①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒

知识点拨：

1、限制酶识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。

2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4个黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取
（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。
（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：

①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
（3）基因表达载体的构建过程：

3、将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用的转化方法：

生物种类	植物细胞	动物细胞	微生物细胞
常用方法	农杆菌转化法	显微注射技术	Ca2+处理法
受体细胞	体细胞	受精卵	原核细胞
转化过程	将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达	将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物	Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

知识点拨：

1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。
3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。
4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。
6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。
知识拓展：

1、基因文库的构建：
（1）概念
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。
②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。
（2）构建过程

基因组文库的构建	cDNA文库的构建

2、人工合成目的基因
（1）反转录法：

（2）人工合成目的基因

3、PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制
②过程：
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

胚胎干细胞培养与应用：

1、概念：哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。
2、特点：
（1）具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；
（2）在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。
（3）ES细胞在饲养层细胞上或在添加抑制因子的培养液中可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。
3、培养关键：需要一种能促进胚胎干细胞的生长，但抑制其分化的一种培养体系，这种体系就是胚胎成纤维细胞。
4、培养过程：

5、胚胎干细胞的主要用途是：
①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；
②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；
③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；
④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；
⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。

干细胞的种类：

类别	来源或举例	特点
全能干细胞	胚胎干细胞	可以分化为全身200多种细胞并进一步形成机体的所有组织、器官
多能干细胞	造血于细胞	具有分化成多种细胞或组织的潜能
专能干细胞	皮肤生发层细胞	只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞

知识拓展：

1、将胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后受体产生克隆动物，操作流程如下：

2、通过基因敲除，获得移植器官。
3、培育出人造组织器官，用于器官移植。
4、改良创造动物新品种。