血红蛋白的提取和分离：

1、实验原理
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。
（1）凝胶色谱法（分配色谱法）：
①原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
②凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

③分离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
④作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。
（2）缓冲溶液
①原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H₂CO₃—NaHCO₃， NaH₂PO₄/Na₂HPO₄等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
②缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
(3）凝胶电泳法：
①原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。
②分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。
③分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质—SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
2、实验步骤
（1）样品处理
① 红细胞的洗涤
洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
②血红蛋白的释放  
在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。
注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。
（2）粗分离
①分离血红蛋白溶液
将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
②透析
取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
（3）纯化：调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
（4）纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

知识点拨：

注意事项
（1）电泳技术
电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。
（2）红细胞的洗涤
如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
（3）如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。
此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
（4）为什么凝胶的装填要紧密、均匀？
如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
（5）沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的
不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。
（6）G-75
“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。
（7）装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密
（8）加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
（9）与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义
哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
（10）如何检测血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。