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高中二年级生物

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    新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术(或仪器)与应用匹配正确的
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    A.PCR技术——扩增蛋白质
    B.杂交瘤技术——制备单克隆抗体
    C.光学显微镜——观察叶绿体的基粒
    D.花药离体培养——培育单倍体植物
    本题信息:2012年广东省期中题生物多选题难度一般 来源:梁波
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本试题 “新技术的建立和应用对生物学发展至关重要。下列技术(或仪器)与应用匹配正确的[ ]A.PCR技术——扩增蛋白质B.杂交瘤技术——制备单克隆抗体C.光学显微镜——观察叶...” 主要考查您对

实验:使用高倍显微镜观察几种细胞

月季的花药培养

多聚酶链式反应扩增DNA片段

单克隆抗体

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显微镜的使用方法:

高倍镜的使用步骤(尤其要注意第1和第4步)
(1)在低倍镜调节(粗准焦螺旋和细准焦螺旋)下找到物象,将物象移至(视野中央)。
(2)转动(转换器),换上高倍镜。
(3)调节(光圈)和(反光镜),使视野亮度适宜。
(4)调节(细准焦螺旋),使物象清晰。

显微镜使用方法总结:

1、一取二放,三安装,四转低倍,五对光,六上玻片,七下降,八升镜筒,细观赏,看完低倍,转高倍,九退!
2、在使用高倍镜时应先用低倍镜找到所要观察的目标,观察的标本应选择没有细胞重叠的区域。
3、若镜头脏了,不能用手擦,也不能用布擦,应用专门的擦镜纸来擦。
4、标本切的厚薄不均匀导致物像一部分清晰,另一部分较模糊。反光镜调整不好,会导致视野一半明亮,一半黑暗。


知识点拨:

(1)进行显微镜对光时,应转动反光镜或是光圈,使视野明亮,便于使用高倍镜观察。
(2)制作临时装片时,如果观察的是植物细胞,在载玻片上滴加清水;如果观察人的口腔上皮细胞,需要滴加质量分数为0.9%的NaCl溶液。
(3)无论选取动物组织细胞还是植物组织细胞,一定要量少,并且要在载玻片上将观察材料展开,以便于观察。
(4)观察时,要遵循先在低倍镜下观察清楚,将物像移至视野中央,再转换高倍镜进行观察的顺序。在使用高倍镜进行观察时,不能转动粗准焦螺旋。


显微镜的结构图:

 

植物细胞和动物细胞的简图:


 知识拓展:

1、低倍镜换高倍镜后细胞数目的计算:
(1)放大倍数问题 放大倍数是指物像的大小与物体大小的比例。显微镜的放大倍数=物镜倍数×目镜倍数。放大倍数指的是物体的宽度或长度的放大倍数,而不是面积或体积的放大倍数。
(2)放大倍数的变化与视野中细胞数目的变化关系:
①若视野中细胞成单行,计算时只考虑长度,可根据看到的细胞数量与放大倍数成反比的规律进行计算。如:在显微镜放大倍数为40倍时看到m个细胞,放大倍数变成400倍时看到的细胞数日=m÷(400÷40)=m/10(个)。
②若视野中细胞均匀分布,可根据看到的细胞数目与放大倍数的平方成反比的规律进行计算。如:在显微镜放大倍数为40倍时看到m个均匀分布的细胞,放大倍数变为400倍时看到的细胞数日=m÷(400÷40)2=m/100(个)。

2、显微镜的放大径向放大,放大倍数是目镜与物镜放大倍数的乘积,且放大的是长和宽不是面积。

3、目镜和物镜的比较:
(1)目镜越长,放大倍数越小,反之放大倍数越大;
(2)物镜上有螺纹,物镜越长放大倍数越大,物象清晰时距离装片越近。

4、污点位置分析:
(1)污点的位置可能有三个:物镜、目镜或装片。
(2)判断方法:先移动装片,若污点移动说明污点在装片上。若不移动,再转动目镜,若污点也转动说明污点在目镜上。若污点不转动,在转动转换器换用其他物镜,若污点消失,说明污点在物镜上。

5、成像:
(1)显微镜的成像特点是倒像,相当于把标本水平转180度后所呈现的状态。如“b”成的物象是“q”。
(2)将物象移到视野中央时,物象在“左下方”就将装片向“左下方”移动,即在哪往哪移。

6、高倍镜、低倍镜与视野大小、明暗的关系:

高倍镜
低倍镜

月季的花药培养:

1、被子植物的花粉发育
(1)被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构,内部含有许多花粉。
(2)花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小包子四分体时期、单核期和双核期等阶段。
 

2、产生划分植株的两种途径:一种是花粉通过胚状体阶段发育为植株,另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织,再将其诱导分化成植株。
 
两种途径之间没有绝对的界限,主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

3、影响花药培养的因素:
(1)材料的选择:一般来说,在单核期(通常是完全未开放的花蕾),细胞核由中央移向细胞一侧的时期,花药成功率最高。
(2)培养基的选择。
(3)此外,亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率又一定影响。
4、材料选取方法:醋酸洋红法和焙花青-铬矾法
5、步骤:
材料的选取→材料的消毒→接种和培养→结果分析与评价


知识点拨:

1、材料的选择要是选择单核期以前的花药接种,质地幼嫩,极易破碎;选择单核期以后的花药接种,花瓣已有些松动,又给材料的消毒带来困难,通常不选择盛开或略微开放的花。
2、选择月季花粉的最佳时期为完全未开放的花蕾。材料的选择是花粉植株能否培养成功的主要影响因素之一,不同植物及同一植物的不同生理状况诱导成功率都不相同。
3、选择花药时,确定花药发育时期最常用的方法是醋酸洋红法。某些植物的花粉不易着色需采用焙花青-铬矾法,这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。
4、材料的消毒过程:
花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡30s→无菌水冲洗→吸干表面的水分,放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2~4min→无菌水再冲洗3~5次。
5、接种和培养过程中注意的情况
在无菌条件下剥离花药时要尽量不损伤花药(否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织),同时还要彻底除去花丝。因为花丝的存在不利于愈伤组织或胚状体的形成。
多聚酶链式反应扩增DNA片段:

1、PCR原理:在解旋酶作用下,打开DNA双链,每条DNA单链作为母链,以4中游离脱氧核苷酸为原料,合成子链,在引物作用下,DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链,即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物,其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。
2、PCR反应过程是:变性→复性→延伸
过程 说明 图解
变性 当温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚为单链
复性 温度下降到50℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸 72℃左右时,TaqDNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸

3、结果:上述三步反应完成后,一个DNA分子就变成了两个DNA分子,随着重复次数的增多,DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。


细胞被DNA复制与PCR技术的比较:

细胞内DNA复制 体外DNA扩增(PCR)
不同点 解旋 在解旋酶作用下边解旋边复制 80~100℃高温解旋,双链完全分开
DNA解旋酶、DNA聚合酶 TaqDNA聚合酶
引物 RNA DNA、RNA
温度 体内温和条件 高温
相同点 ①需提供DNA模板
②四种脱氧核苷酸为原料
③子链延伸的方向都是从5'端到3'端

知识点拨:

1、DNA分子复制的人工控制
解开螺旋:在80~100℃时,DNA双螺旋打开,形成两条DNA单链,称为变性。
恢复螺旋:在50~60℃左右时,两条DNA单链重新形成双螺旋结构,称为复性。
复制条件:缓冲液,DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。
控制仪器:PCR仪(温度周期性自动调节仪)。
2、PCR的含义是多聚酶链式反应。
3、PCR技术反应的条件:①稳定的缓冲溶液环境;②DNA模板;③合成引物;④四种脱氧核甘酸;⑤DNA聚合酶;⑥温控设备
4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。
5、TaqDNA聚合酶的特点是:耐高温。
知识拓展:

1、DNA含量的测定——分光光度法
项目 说明
原理 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈吸收峰,峰值大小与DNA的含量是正相关
过程 稀释 2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释
对照调零 以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处,将紫外分光光度计的赌注调节至零
测量 取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值
计算 DNA含量(μg/mL)=50×(260nm的读数)×稀释倍数
2、DNA聚合酶不恩能够从头合成DNA,只能从DNA的3'端开始延伸DNA链,因此DNA复制需要引物。
单克隆抗体:

1、抗体:一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备
(1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞:向免疫小鼠体内注射特定的抗原,然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞
(2)获得杂交瘤细胞
①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合;
②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
(3)克隆化培养和抗体检测
(4)将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
(5)提取单克隆抗体:从细胞培养液或小鼠的腹水中提取
3、单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂,具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。


血清抗体与单克隆抗体的比较:

名称 产生 特点
血清抗体 由B淋巴 一般从血清中分离,产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体 由杂交瘤细胞分泌 特异性强,灵敏度高,能大量制备

知识点拨:

1、融合的结果是有很多不符合要求的;如有2个B淋巴细胞融合的细胞等,所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点:特异性强,灵敏度高,并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用:作为诊断试剂:准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物:主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展:

制备单克隆抗体过程中的筛选:筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰,筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种,形成的杂交瘤细胞有很多种,所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。

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