观察根尖分生组织细胞的有丝分裂：

一．实验目的：
（1）制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片
（2）观察植物细胞有丝分裂的过程，识别有丝分裂的不同时期，比较细胞周期不同时期的时间长短。
（3）绘制植物细胞有丝分裂简图。
二．实验原理：
（1）在高等植物体内，有丝分裂常见于根尖、芽尖等分生区细胞。由于各个细胞的分裂是独立进行的，因此在同一分生组织中可以看到处于不同分裂时期的细胞。
（2）染色体容易被碱性染料(如龙胆紫溶液)着色，通过在高倍显微镜下观察各个时期细胞内染色体（或染色质）的存在状态，就可判断这些细胞处于有丝分裂的哪个时期，进而认识有丝分裂的完整过程。
（3）细胞的分裂具有独立性：同一组织的不同细胞，在同一时间内可处于细胞周期的不同分裂时期。
三．实验步骤：
(1)洋葱根尖培养：课前3-4d，将洋葱放在盛满清水的广口瓶上，让底都接触水，放置温暖处，待根长至5cm时取用。
(2)制作临时装片 (解离→漂洗→染色→制片)

（3）观察：先用低倍镜观察，找到分生区。分生区细胞的特点是细胞呈正方形，排列紧密。然后把观察目标移到视野中央，再换高倍镜观察有丝分裂各个时期的细胞图像。

知识点拨：

1、制作好洋葱根尖有丝分裂装片的关键有以下几点：
（1）剪取洋葱根尖材料时，应该在洋葱根尖细胞一天之中分裂最活跃的时间；
（2）解离时，要将根尖细胞杀死，细胞间质被溶解，使细胞容易分离；
（3）压片时，用力的大小要适当，要使根尖被压平，细胞分散开。
2、操作要点
(1)解离：
①通过解离将细胞杀死，使细胞停留在不同的分裂时期。
②解离的目的是使组织细胞相互分离开。
③解离时间不宜过长或过短：过长会使根尖过分酥软且染色体成分被破坏；过短使根尖细胞解离不充分，不能相互分离开。
(2)漂洗：漂洗一定要彻底，防止残留的解离液继续破坏细胞，同时盐酸也影响染色和腐蚀镜头。
(3)染色：染色液的浓度和染色时间必须掌握好，应注意染色不能过深，否则镜下一片紫色，无法观察。
(4)压片：用力要恰当均匀，过重可能将组织压烂' 过轻则不能将细胞分散开。
(5)显微镜下观察的都是死细胞，不能看到细胞分裂的动态变化，若视野中找不到某一时期的细胞，可通过移动装片从邻近的区域中找。
知识拓展：

1、“酒精”在不同实验中的作用：
(1)体积分数95﹪的酒精：与质量分数15%的HCI 溶液按1:1的体积比混合作解离液，用于观察根尖分生组织细胞有丝分裂的实验。
(2)体积分数50﹪的酒精：检测生物组织中（如花生子叶切片）脂肪实验中，用于洗去苏丹Ⅲ染色剂染色后切片上的浮色。
(3)无水乙醇：叶绿体中色素提取与分离实验中用作色素提取剂。
(4)质量分数70%的酒精：常用作实验材料或消毒剂。
2、与细胞分裂有关的细胞器：

细胞器名称	细胞类型	时期	生理作用
核糖体	动物、植物	整个时期，但是主要是间期	各种蛋白质（组成染色体的蛋白质和细胞内的其他蛋白质）的合成
中心体	动物、低等植物	前期	纺锤体的形成
高尔基体	植物	末期	细胞壁的形成
线粒体	动物、植物	整个时期	提供能量

果酒和果醋的制作：

一、实验原理
（1）酵母菌的细胞呼吸
①酵母菌是营异养生活的真菌。
②酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，表达式为：C₆H₁₂O₆+O₂→CO₂+H₂O+能量（反应中均需要酶的参与）
③酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，表达式为：C₆H₁₂O₆→C₂H₅OH+CO₂+能量（反应中均需要酶的参与）
（2）酵母菌发酵的最佳环境
①酵母菌在有氧和无氧的条件下都能生活：在有氧时，酵母菌大量繁殖，但是不起到发酵效果；在无氧时，繁殖速度减慢，但是此时可以进行发酵。
②在利用酵母菌发酵时最好是先通入足够的无菌空气在有氧环境下一段时间使其繁殖，再隔绝氧气进行发酵。
③20℃左右最适合酵母菌繁殖，酒精发酵的最佳温度是在18℃～25℃。
④pH最好是弱酸性。
（3）醋酸菌好氧性细菌，当缺少糖源时和有氧条件下，可将乙醇（酒精）氧化成醋酸。
①表达式为：C₂H₅OH→CH₃COOH+H₂O；当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
②醋酸菌生长的最佳温度是在30℃～35℃
二、果酒果醋的制作

项目	果酒的制作	果醋的制作
主要菌种	酵母菌	醋酸菌
原理	果酒：酵母菌的无氧呼吸	果醋：醋酸菌有氧呼吸 （1）当氧气、糖源都充足时，糖→醋酸 （2）当缺少糖源时，乙醇→乙醛→醋酸
实验流程	挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒	挑选葡萄→冲洗→榨汁→醋酸发酵→果醋
温度	18～25℃	30～35℃
氧的需求	前期需氧，后期不需氧	需充足氧
提示	在果酒制作过程的前期通入空气或在发酵瓶中留有一定的空间（大约1/3），可以给酵母菌提供氧气，使其进行 有氧呼吸，为酵母菌的生长、增殖提供能量，酵母菌迅速增殖，缩短发酵时间。在生产酒精的阶段要求严格的无氧环境，此阶段如果有氧，则会抑制酒精发酵。	果醋制作过程中要求始终通氧，因为醋酸菌是好氧细菌，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响，另外醋酸的生成也会受到影响。

知识拓展：

1、注意问题：充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出CO₂的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，其目的是防止空气中微生物的污染。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气。


2、特别提醒：在葡萄酒的自然发酵过程中，起主要作用的事附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。发酵过程中，随着酒精度地提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈深红色。在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌能大量生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。
3、注意事项：
（1）果醋的制作需用醋酸菌，醋酸菌是一种好氧菌，所以在制作过程中需通氧气；当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄糖氧化成醋酸；醋酸菌的呼吸作用为严格的有氧呼吸。
（2）防止发酵液被污染的方法：
①榨汁机要清洗干净，并晾干
②发酵瓶要清洗干净，用体积分数为70%的酒精消毒
③装入葡萄汁后，封闭充气口
④发酵装置的排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接
（3）榨汁机要清洗干净并晾干；将先冲洗后除梗的葡萄放入冲洗晾干的榨汁机内进行榨汁。
（4）产醋最多的措施：往果酒中加入变酸的酒表面的菌膜，并通气。醋酸菌能将葡萄汁中的糖分解成醋酸的条件：氧气、糖源充足。
（5）在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，正确的操作是给发酵装置适时排气。
（6）发酵条件：葡萄汁装入发酵瓶时，要留有约1/3的空间；制葡萄酒的过程中，除在适宜的条件下，时间应控制在10d～12d左右；制葡萄醋的温度要比制葡萄酒的温度高些，但时间一般控制在7d～8d左右。
（7）酒精与重铬酸钾在酸性条件下发生的颜色反应为灰绿色。

DNA的粗提取与鉴定：

一、实验原理
提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
1、DNA的溶解性
（1）DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同（0.14mol/L溶解度最低），利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
 
（2）DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离。
2、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3、DNA的鉴定
在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
1、实验材料的选取
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2、破碎细胞，获取含DNA的滤液 
动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3、去除滤液中的杂质 
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA；方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
4、DNA的析出与鉴定
（1）将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等、冷却的酒精溶液，静置2～3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。
（2）取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。

实验步骤——以洋葱为实验材料：

1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化钠溶液，充分研磨。
洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。
2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。
3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。
此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。这就是记录生命遗传信息的重要物质——DNA。DNA析出的过程中，切忌震动和搅拌（不震动易于分层，我们就能很容易观察到上清液中的丝状物；搅拌会使非常柔软的DNA断裂成小段，不易取出）。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙签，DNA提取物就缠绕在牙签上了。
4、鉴定：取两支试管，编为1、2号，各加入2mol/L的氯化钠溶液2mL，向1号试管中加入一些白色纤维状物，振荡使其溶解，然后向两支试管中各加入2mL二苯胺试剂，沸水浴加热5分钟。
DNA与蛋白质在NaCl溶液中溶解度比较：

	2mol/LNaCl溶液	0.14mol/LNaCI溶液	溶解规律
DNA	溶解	析出
蛋白质	部分发生盐析沉淀	溶解	NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大

知识点拨：

1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。
2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶3、如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响?
研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
4、为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
5、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠防止血液凝固。
6、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
7、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
8、DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系：
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，随浓度的升高，DNA的溶解度降低；当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时，随浓度升高，DNA的溶解度升高。
9、盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。
10、本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。
11、实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破释放出DNA，第二次日的是稀释 NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。