微生物发酵及其应用：

1、发酵工程的历史发展
（1）自然发酵时期早在数千年前，我国劳动人民就懂得酿酒、制酱油、酿醋等。酿酒工业是历史上最古老的微生物工业，但当时人们并不知道它与微生物的关系，也不清楚发酵的原因，只是靠口传身授，在实践中应用微生物。例如，嫌气性发酵用于酒类酿造，好气性发酵用于酿醋、制曲，这是古典发酵的特点，这一时期称为自然发酵时期。
（2）纯培养技术时期
1667年，荷兰人列文霍克（AntonyVanLeowenhoek）发明了显微镜，揭开了微生物世界的秘密。随着微生物的发现，1850-1880年法国巴斯德（LouisPasteur）通过实验发现了发酵原理，认识到发酵是由微生物的活动引起的。随着微生物纯培养技术的逐步完善，开创了人为控制微生物的新时代。采用杀菌操作，发明了简便的密闭式发酵罐等技术设备，使发酵失败现象（如腐败）大大减少，即人工控制环境条件使发酵效率迅速提高。嫌气性发酵由此逐步发展起来，产品包括酒精、丙酮、丁醇等。在世界范围内利用微生物分解代谢进行规模化工业生产经历了100多年的历史。因此，微生物纯培养技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第一个转折时期。
（3）通气搅拌的好气性发酵工程技术时期
1929年，英国细菌学家傅莱明（Fleming）发现了青霉素。随着青霉素大规模生产的成功，实验室采用摇瓶通风培养以及空气纤维过滤的高效除菌，在20世纪40年代创立了好气性发酵通气搅拌工程技术。抗生素工业的兴起不仅使微生物技术应用到医药工业，而且大大促进了好气性发酵工程和微生物工业的发展。微生物工程已经从分解代谢转为生物合成代谢，可以利用微生物合成积累大量有用的代谢产物，如各种有机酸、酶制剂、维生素、激素等，这已超越微生物正常代谢的范围。因此，通气搅拌的好气性发酵工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第二个转折时期。
（4）人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期
随着微生物遗传学、生物化学和分子生物学的发展，促进了20世纪60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立，这是遗传水平上控制微生物代谢的结果。日本于1956年用发酵法生产谷氨酸获得成功，至今可用发酵法生产22种氨基酸，其中18种是直接发酵，4种是酶法转化。氨基酸发酵工业采用了人工诱变育种与代谢控制发酵的新技术，即首先将微生物进行人工诱变，得到适合生产某种产物的突变株，然后通过人工控制培养，选择性地大量生产人们所需要的物质。此项工程技术已用于核苷酸类物质、有机酸和一部分抗生素的发酵生产。因此，代谢控制发酵工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第三个转折时期。
（5）发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期
随着微生物工业向大型发酵罐的连续化、自动化方向发展，以数学、动力学、化工原理等为基础，通过计算机实现发酵过程自动化控制的研究，使发酵过程的工艺控制更为合理，相应的新工艺、新设备也层出不穷。例如，日本的塔式连续发酵设备适用于各种连续通风发酵。法国L-M型单级连续发酵槽用于酵母菌连续培养，其结构简单而效率却相当高。世界上最新设计的实验型万能发酵罐适于任何发酵生产，可同时记录24个物理、化学和生物化学数据。目前，发酵过程的基本参数，包括温度、pH值、罐压、溶解氧、氧化还原电位、通气流量、CO₂含量等均可自动记录和控制。可见，发酵的连续化、自动化工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第四个转折时期。
（6）微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期
随着微生物合成工程技术与化学合成工程技术的不断应用，矿产物的开发和石油化工的发展为化学合成法提供了丰富的原料，用于生产一些低分子的有机化合物，如乙醇、丙酮及丁醇等，美国工业应用化学合成法可以生产100多种发酵产品，如大部分的酒精、丙酮、丁醇等，部分的葡萄糖酸、谷氨酸、乳酸等。对于那些用化学合成法不能生产的一些复杂化合物，采用微生物发酵合成法可以在常温、常压下一步完成，特别是可以直接生产一些具有立体特异性的化合物，且生产设备投资较少。但发酵法也存在目的代谢产物浓度较低、分离较困难、生产周期较长等不利因素。
而微生物酶反应生物合成与化学合成工程技术的结合，可生产许多过去不能生产的有用物质。例如，抗生素的化学结构改造是获得新的高效抗生素的重要来源，而维生素C是最早成功的例子，即先利用微生物将山梨糖醇发酵转变为山梨糖，再通过化学合成法生产维生素C。或者先用化学合成法生产廉价的前体，再用发酵法生产出贵重产品。目前，采用此项新技术可大规模生产多种物质，如激素、核苷酸、新抗生素（如半合成头孢霉素、卡那霉素、氯霉素等）、某些氨基酸（如L-酪氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸等）等，随着研究的深入将能生产更多有用的物质。因此，微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第五个转折时期。
2、发酵生产过程探秘
（1）发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
（2）由于不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力，因此，利用不同的微生物就可以产生出人们所需要的多种产物。
（3）现代发酵工业产品大多数是好氧微生物发酵产生的，但也有一部分产品是利用厌氧微生物发酵产生的。
3、发酵与食品生产：菌种选育→菌种的扩大培养→培养基的配制→灭菌和接种→发酵条件的控制→分离和提纯。

基因工程的应用：

1、植物基因工程：

	外源基因类型及举例	成果举例
抗虫转基因植物	抗虫基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因	抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米
抗病转基因植物	(1)抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因(2)抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因	抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒
抗逆转基因植物	抗逆基因：调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因	抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米
改良品质的转基因植物	优良性状基因：提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因	高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛

2、动物基因工程：

	外源基因类型及举例	成果举例
提高生长速度的转基因动物	外源生长激素基因	转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物	肠乳糖酶基因	乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物	药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子	乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物	外源的抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因	无免疫排斥的转基因猪

3、基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断：DNA分子杂交法（即DNA探针法），该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链 DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA 中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
(2)基因治疗的方法：基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。
(3)基因治疗的途径
①体外基因治疗：先从病人体内获得某种细胞进行培养，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。
②体内基因治疗：用基因工程的方法，直接向人体

知识拓展：

1、Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
2、青霉素是谤变后的高产青霉菌产生的，不是通过基因工程改造的工程菌产生的。
3、动物基因工程的应用主要体现在提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物等方面。 4、动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。
5、乳腺生物反应器产量高、质量好、成本低、易提取，在高价值蛋白质的生产上比工厂化生产更具有优越性二。
6、用基因工程的方法，使外源基因得以高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。
7、基因诊断是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。基因治疗指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
8、基因工程与环境保护
亲子鉴定：利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。
使用国产制剂进行亲子鉴定
鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定，十分方便。
利用DNA进行亲子鉴定，只要作十几至几十个DNA位点作检测，如果全部一样，就可以确定亲子关系，如果有3个以上的位点不同，则可排除亲子关系，有一两个位点不同，则应考虑基因突变的可能，加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定，否定亲子关系的准确率几近100%，肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。
9、基因芯片的基本原理：就是最基本的DNA分子杂交，利用基因芯片检测某种基因时，先将待测样品制成荧光标记的DNA探针，让它与基因芯片上已知序列的DNA片段杂交，杂交信号经放大后输入计算机进行统计分析，这样就可以检测出样品DNA序列。
用途：用来检测基因表达的变化、分析基因序列、寻找新的基因和新的药物分子。利用基因芯片，可以比较同一物种不同个体或物种之间，以及同一个体在不同生长发育阶段、正常和疾病状态下基因表达的差异，寻找和发现新的基因，研究基因的功能以及生物体在进化、发育、遗传等过程中的规律。

动物细胞的核移植技术：

1．原理：动物细胞核的全能性和细胞膜具一定的流动性。
2．种类：动物核移植技术可以分为胚胎细胞核移植和体细胞核移植，前者比较容易。
3．材料
(1)供体细胞一般选优良动物的传代培养10代以内的细胞。
(2)受体细胞一般为减数第二次分裂中期的次级卵母细胞：①卵母细胞质内存在激发细胞核全能性表达的物质；②卵母细胞体积大，便于操作；③卵黄多，营养物质丰富。
4．过程


体细胞核移植的大致过程是：
高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作） ；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。
5、体细胞核移植技术的应用：
①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；
②保护濒危物种，增大存活数量；
③生产珍贵的医用蛋白；
④作为异种移植的供体；
⑤用于组织器官的移植等。

知识点拨：

选用去核卵（母）细胞的原因：卵（母）细胞比较大，容易操作；卵（母）细胞细胞质多，营养丰富； 细胞质不会抑制细胞核全能性的表达。
知识拓展：

1、体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
2、细胞核移植技术中注入去核卵母细胞中的不是供体细胞核，而是整个细胞，佯随着两细胞融合，体现细胞膜的结构特点：具有一定的流动性。
3、核移植时，一般先用电刺激使供受体细胞融合，再用物理或化学方法激活受体细胞，使其完成细胞分裂和发育进程。
4、克隆动物的性状与核供体生物的性状基本相同，而不是完全相同，因为克隆动物的细胞质遗传物质来自于受体卵母细胞；生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。
5、克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。

体外受精与胚胎的早期培养：

1、体外受精的原理：人工模拟体内环境（包括营养、温度、pH等），使初级卵母细胞成熟和精子获能，最
终完成受精和胚胎保存。
2、体外受精主要操作步骤
（1）卵母细胞的采集和培养：
方法一：对小型动物一般用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。
方法二：对大型动物是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞，在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精（或从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞）
（2） 精子的采集和获能：在体外受精前，要对精子进行获能处理。
采集方法：假阴道法、手握法和电刺激法等。
获能方法：培养法和化学法。
（3） 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。
3、胚胎的早期培养：
（1）培养目的：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。
（2）培养液成分：除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。
（3）当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。（牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植）。
知识拓展：

1、早期胚胎是指可用于移植的胚胎，在原肠胚之前的囊胚、桑椹胚甚至更早的阶段。
2、受精后形成的受精卵需经早期发育培养，才能完成植入或着床。
3、胚胎早期培养液成分与动物细胞培养液成分基本相同，除无机盐、营养成分和调节物质外，还需要血清、抗生素等，两者都是液体培养基，但植物组织培养为固体培养基，其中加入琼脂，所需植物激素主要是生长素和细胞分裂素两大类。