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高中三年级生物

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    “筛选”是生物工程中常用的技术手段,下列关于筛选的叙述中错误的是
    [     ]

    A.单克隆抗体制备过程中,在完成细胞融合后,第一次筛选的目的是筛选出针对目标抗原的抗体为阳性的杂交瘤细胞
    B.单克隆抗体制备过程中,在完成细胞融合后,第一次筛选的目的是筛选出杂交瘤细胞
    C.基因工程中用不同种限制性核酸内切酶切割运载体和目的基因。
    D.重组质粒上的标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
    本题信息:2011年广东省模拟题生物多选题难度一般 来源:姚瑶
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本试题 ““筛选”是生物工程中常用的技术手段,下列关于筛选的叙述中错误的是[ ]A.单克隆抗体制备过程中,在完成细胞融合后,第一次筛选的目的是筛选出针对目标抗原的...” 主要考查您对

DNA重组技术的基本工具

单克隆抗体

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DNA重组技术的基本工具:

1、基因工程的概念:
基因工程的别名 基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境 生物体外
操作对象 基因
操作水平 DNA分子水平
基本过程 剪切→拼接→导入→表达
结果 人类需要的基因产物
2、基本工具:
(1)“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。
③结果:经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。
即 当限制性内切酶作用于特定的DNA时,把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况:
a、沿着中轴线切口(即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键)切开,得到的就是两个平末端;
b、在中轴线的两端切口切开,得到的就是两个黏性末端。例如:EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列,然后在G和A间切开,得到的就是两个黏性末端(之间可以根据碱基互补配对原则重组)限制酶的切口不都是一长一短的,一长一短的叫黏性末端,一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图:


(2)“分子缝合针”——DNA连接酶
种类 E·coli-DNA连接酶 T4-DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
功能特性 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来 缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低
相同点 都缝合磷酸二酯键,如图:
 
(3)“分子运输车”——载体
①载体具备的条件:能在受体细胞中复制并稳定保存;具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段插入;具有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
③其它载体:噬菌体的衍生物、动植物病毒

知识点拨:

1、限制酶识别的序列的特点:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴,两侧碱基互补对称;为轴,两侧碱基互补对称。

2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。
3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次,共产生 4个黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性,以便于检测。


单克隆抗体:

1、抗体:一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备
(1)制备产生特异性抗体的B淋巴细胞:向免疫小鼠体内注射特定的抗原,然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞
(2)获得杂交瘤细胞
①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合;
②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
(3)克隆化培养和抗体检测
(4)将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
(5)提取单克隆抗体:从细胞培养液或小鼠的腹水中提取
3、单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂,具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。


血清抗体与单克隆抗体的比较:

名称 产生 特点
血清抗体 由B淋巴 一般从血清中分离,产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体 由杂交瘤细胞分泌 特异性强,灵敏度高,能大量制备

知识点拨:

1、融合的结果是有很多不符合要求的;如有2个B淋巴细胞融合的细胞等,所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点:既能大量繁殖,又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点:特异性强,灵敏度高,并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用:作为诊断试剂:准确识别各种抗原物质的细微差异,并跟一定抗原发生特异性结合,具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物:主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展:

制备单克隆抗体过程中的筛选:筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰,筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种,形成的杂交瘤细胞有很多种,所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。

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