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高中二年级生物

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    天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类,用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌,获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题:
    (1)将淀粉酶基因切割下来所用的工具是________,用________将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子,下一步将该DNA分子_________,以完成工程菌的构建。
    (2)若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌,可采用的检测方法是________;若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶,可采用_______检测;将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上,培养一定时间后,加入碘液,工程菌周围出现透明圈。请解释该现象发生的原因。__________________________。
    (3)如何进一步鉴定不同的转基因工程菌菌株利用淀粉能力的大小?
    (4)微生物在基因工程领域中有哪些重要作用?
    本题信息:2011年同步题生物填空题难度较难 来源:姚瑶
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本试题 “天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类,用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌,获...” 主要考查您对

微生物发酵及其应用

基因工程的基本操作程序

基因工程的应用

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微生物发酵及其应用:

1、发酵工程的历史发展
(1)自然发酵时期早在数千年前,我国劳动人民就懂得酿酒、制酱油、酿醋等。酿酒工业是历史上最古老的微生物工业,但当时人们并不知道它与微生物的关系,也不清楚发酵的原因,只是靠口传身授,在实践中应用微生物。例如,嫌气性发酵用于酒类酿造,好气性发酵用于酿醋、制曲,这是古典发酵的特点,这一时期称为自然发酵时期。
(2)纯培养技术时期
1667年,荷兰人列文霍克(AntonyVanLeowenhoek)发明了显微镜,揭开了微生物世界的秘密。随着微生物的发现,1850-1880年法国巴斯德(LouisPasteur)通过实验发现了发酵原理,认识到发酵是由微生物的活动引起的。随着微生物纯培养技术的逐步完善,开创了人为控制微生物的新时代。采用杀菌操作,发明了简便的密闭式发酵罐等技术设备,使发酵失败现象(如腐败)大大减少,即人工控制环境条件使发酵效率迅速提高。嫌气性发酵由此逐步发展起来,产品包括酒精、丙酮、丁醇等。在世界范围内利用微生物分解代谢进行规模化工业生产经历了100多年的历史。因此,微生物纯培养技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第一个转折时期。
(3)通气搅拌的好气性发酵工程技术时期
1929年,英国细菌学家傅莱明(Fleming)发现了青霉素。随着青霉素大规模生产的成功,实验室采用摇瓶通风培养以及空气纤维过滤的高效除菌,在20世纪40年代创立了好气性发酵通气搅拌工程技术。抗生素工业的兴起不仅使微生物技术应用到医药工业,而且大大促进了好气性发酵工程和微生物工业的发展。微生物工程已经从分解代谢转为生物合成代谢,可以利用微生物合成积累大量有用的代谢产物,如各种有机酸、酶制剂、维生素、激素等,这已超越微生物正常代谢的范围。因此,通气搅拌的好气性发酵工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第二个转折时期。
(4)人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期
随着微生物遗传学、生物化学和分子生物学的发展,促进了20世纪60年代氨基酸、核苷酸微生物工业的建立,这是遗传水平上控制微生物代谢的结果。日本于1956年用发酵法生产谷氨酸获得成功,至今可用发酵法生产22种氨基酸,其中18种是直接发酵,4种是酶法转化。氨基酸发酵工业采用了人工诱变育种与代谢控制发酵的新技术,即首先将微生物进行人工诱变,得到适合生产某种产物的突变株,然后通过人工控制培养,选择性地大量生产人们所需要的物质。此项工程技术已用于核苷酸类物质、有机酸和一部分抗生素的发酵生产。因此,代谢控制发酵工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第三个转折时期。
(5)发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期
随着微生物工业向大型发酵罐的连续化、自动化方向发展,以数学、动力学、化工原理等为基础,通过计算机实现发酵过程自动化控制的研究,使发酵过程的工艺控制更为合理,相应的新工艺、新设备也层出不穷。例如,日本的塔式连续发酵设备适用于各种连续通风发酵。法国L-M型单级连续发酵槽用于酵母菌连续培养,其结构简单而效率却相当高。世界上最新设计的实验型万能发酵罐适于任何发酵生产,可同时记录24个物理、化学和生物化学数据。目前,发酵过程的基本参数,包括温度、pH值、罐压、溶解氧、氧化还原电位、通气流量、CO2含量等均可自动记录和控制。可见,发酵的连续化、自动化工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第四个转折时期。
(6)微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期
随着微生物合成工程技术与化学合成工程技术的不断应用,矿产物的开发和石油化工的发展为化学合成法提供了丰富的原料,用于生产一些低分子的有机化合物,如乙醇、丙酮及丁醇等,美国工业应用化学合成法可以生产100多种发酵产品,如大部分的酒精、丙酮、丁醇等,部分的葡萄糖酸、谷氨酸、乳酸等。对于那些用化学合成法不能生产的一些复杂化合物,采用微生物发酵合成法可以在常温、常压下一步完成,特别是可以直接生产一些具有立体特异性的化合物,且生产设备投资较少。但发酵法也存在目的代谢产物浓度较低、分离较困难、生产周期较长等不利因素。
而微生物酶反应生物合成与化学合成工程技术的结合,可生产许多过去不能生产的有用物质。例如,抗生素的化学结构改造是获得新的高效抗生素的重要来源,而维生素C是最早成功的例子,即先利用微生物将山梨糖醇发酵转变为山梨糖,再通过化学合成法生产维生素C。或者先用化学合成法生产廉价的前体,再用发酵法生产出贵重产品。目前,采用此项新技术可大规模生产多种物质,如激素、核苷酸、新抗生素(如半合成头孢霉素、卡那霉素、氯霉素等)、某些氨基酸(如L-酪氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸等)等,随着研究的深入将能生产更多有用的物质。因此,微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术的创立是微生物工程发酵技术发展的第五个转折时期。
2、发酵生产过程探秘
(1)发酵是利用微生物,在适宜的条件下,将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。
(2)由于不同的微生物具有产生不同代谢产物的能力,因此,利用不同的微生物就可以产生出人们所需要的多种产物。
(3)现代发酵工业产品大多数是好氧微生物发酵产生的,但也有一部分产品是利用厌氧微生物发酵产生的。
3、发酵与食品生产:菌种选育→菌种的扩大培养→培养基的配制→灭菌和接种→发酵条件的控制→分离和提纯。
基因工程的基本操作程序:

1、目的基因的获取
(1)目的基因是指: 编码蛋白质的结构基因。
(2)获取方法:①从基因文库中获取;②人工合成(反转录法和化学合成法);③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建
(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图:

①启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。
②终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端。
③标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
(3)基因表达载体的构建过程:

3、将目的基因导入受体细胞
(1)转化的概念:是目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)常用的转化方法:
生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(3)重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达
(1)首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。
(2)其次还要检测目的基因是否转录出mRNA,方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
(4)有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

知识点拨:

1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下,便于获得所需的目的基因。
2、PCR技术:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法,也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的:通过指数式扩增获取大量的目的基因。
3、基因文库中不是直接保管相应基因,基因文库中的基因保存在受体菌中。
4、在基因工程的四个操作步骤中,只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对,其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,有利于目的基因的复制与表达,因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。
6、植物细胞的全能性较高,可经植物组织培养过程成为完整植物体,因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中,从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象,从其变化的实质看,这种变异属于可遗传变异中的基因重组。
知识拓展:

1、基因文库的构建:
(1)概念
①基因组文库:含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因组文库。
②cDNA文库:只包含了一种生物的部分基因。
(2)构建过程
基因组文库的构建 cDNA文库的构建
2、人工合成目的基因
(1)反转录法:

(2)人工合成目的基因

3、PCR技术扩增目的基因
①原理:DNA双链复制
②过程:
第一步:加热至90~95℃DNA解链;
第二步:冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;
第三步:加热至70~75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
基因工程的应用:

1、植物基因工程:
外源基因类型及举例 成果举例
抗虫转基因植物 抗虫基因:Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因 抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米
抗病转基因植物 (1)抗病毒基因:病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶基因(2)抗真菌基因:几丁质酶基因、抗毒素合成基因 抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒
抗逆转基因植物 抗逆基因:调节细胞渗透压基因、抗冻蛋白基因、抗除草剂基因 抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米
改良品质的转基因植物 优良性状基因:提高必需氨基酸含量的蛋白质编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因 高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛
2、动物基因工程:
外源基因类型及举例 成果举例
提高生长速度的转基因动物 外源生长激素基因 转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物 肠乳糖酶基因 乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物 药用蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子 乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物 外源的抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因 无免疫排斥的转基因猪
3、基因诊断与基因治疗
(1)基因诊断:DNA分子杂交法(即DNA探针法),该方法是根据碱基互补配对原则,把互补的双链 DNA解开,把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记,之后同被检测的DNA 中的同源互补序列杂交,从而检出所要查明的DNA或基因。
(2)基因治疗的方法:基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。
(3)基因治疗的途径
①体外基因治疗:先从病人体内获得某种细胞进行培养,然后在体外完成基因转移,再筛选成功转移的细胞扩增培养,最后重新输入患者体内。如腺苷酸脱氨酶基因的转移。
②体内基因治疗:用基因工程的方法,直接向人体

知识拓展:

1、Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性,进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。
2、青霉素是谤变后的高产青霉菌产生的,不是通过基因工程改造的工程菌产生的。
3、动物基因工程的应用主要体现在提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物等方面。 4、动物基因工程主要为了改善畜产品的品质,不是为了产生体型巨大的个体。
5、乳腺生物反应器产量高、质量好、成本低、易提取,在高价值蛋白质的生产上比工厂化生产更具有优越性二。
6、用基因工程的方法,使外源基因得以高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”。
7、基因诊断是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体。基因治疗指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。
8、基因工程与环境保护
亲子鉴定:利用医学、生物学和遗传学的理论和技术,从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点,分析遗传特征,判断父母与子女之间是否是亲生关系。
使用国产制剂进行亲子鉴定
鉴定亲子关系目前用得最多的是DNA分型鉴定。人的血液、毛发、唾液、口腔细胞及骨头等都可以用于亲子鉴定,十分方便。
利用DNA进行亲子鉴定,只要作十几至几十个DNA位点作检测,如果全部一样,就可以确定亲子关系,如果有3个以上的位点不同,则可排除亲子关系,有一两个位点不同,则应考虑基因突变的可能,加做一些位点的检测进行辨别。DNA亲子鉴定,否定亲子关系的准确率几近100%,肯定亲子关系的准确率可达到99.99%。
9、基因芯片的基本原理:就是最基本的DNA分子杂交,利用基因芯片检测某种基因时,先将待测样品制成荧光标记的DNA探针,让它与基因芯片上已知序列的DNA片段杂交,杂交信号经放大后输入计算机进行统计分析,这样就可以检测出样品DNA序列。
用途:用来检测基因表达的变化、分析基因序列、寻找新的基因和新的药物分子。利用基因芯片,可以比较同一物种不同个体或物种之间,以及同一个体在不同生长发育阶段、正常和疾病状态下基因表达的差异,寻找和发现新的基因,研究基因的功能以及生物体在进化、发育、遗传等过程中的规律。
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