分解纤维素的微生物的分离:
(1)实验原理:
①土壤中存在着大量纤维素分解酶,包括真菌、细菌和放线菌等,它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶,可以把纤维素分解为纤维二糖,进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用,故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中,纤维素分解菌能够很好地生长,其他微生物则不能生长。
②在培养基中加入刚果红,可与培养基中的纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,红色复合物不能形成,培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,从而可筛选纤维素分解菌。
(2)实验过程:
土壤取样:采集土样时,应选择富含纤维素的环境
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梯度稀释:用选择培养基培养,以增加纤维素分解菌的浓度
↓
梯度稀释
↓
涂布平板:将样品涂布于含刚果红的鉴别纤维素分解菌的固体培养基上
挑选产生中心透明圈的菌落:产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈,从产生明显的透明圈的菌落上挑取部分细菌,并接种到纤维素分解菌的选择培养基上,在30~37℃条件下培养,可获得较纯的菌种。
刚果红染色的两种方法的比较:
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先培养微生物,在加入刚果红 |
在到平板时加入刚果红 |
优点 |
显示出的眼神反映基本上是纤维素分解菌的作用 |
操作简便,不存在菌落混杂问题 |
缺点 |
操作繁琐,加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂 |
(1)由于琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质,可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应 (2)有些微生物具有降解色素的能力,长时间培养会降解刚果红,从而形成明显的透明圈,这些微生物与纤维素分解菌不易区分 |
知识拓展:
1.纤维素与纤维素酶
(1)纤维素
①化学本质:一种多糖。
②分布:棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物,此外,木材、作物秸秆等也富含纤维素。
(2)纤维素酶
①习惯上,将纤维素酶分成三类:C1酶、Cx酶和β葡糖苷酶。C1酶是对纤维素最初起作用的酶,破坏纤维素链的结晶结构。Cx酶是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1,4-糖苷键的纤维素酶。β葡糖苷酶可以将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。
②作用:纤维素
纤维二糖
葡萄糖
2、为确定得到的微生物是纤维素分解菌,还需进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法,一般是对纤维素酶分解滤纸等纤继素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
酶的制备和活力的测定:酶活力(enzymeactivity):也称为酶活性,是指酶在催化一定的化学反应时表现出来的能力,通常用酶促反应的速率即酶促反应过程中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示。酶活力的高低会受温度、pH、激活剂等多种因素的影响。酶的提取一般选择在低温和适合的pH下进行,有时还要加入酶的激活剂以提高酶活力。例如,从植物材料中提取果胶酶就是在低温、偏酸性的提取液和NaCl作激活剂的条件下进行的。
一、制备果胶酶
1、实验材料和器具:新鲜的水果或蔬菜;质量分数为10%的NaCl溶液,0.1mol/L冰醋酸;研钵,剪刀,漏斗,纱布或滤纸,烧杯,精密pH试纸,试管,酒精灯,离心机,榨汁机等。
2、果胶酶的制备:
(1)将50g新鲜的水果或蔬菜洗净,在预冷的研钵内用剪刀迅速剪碎后研磨,边研磨边加入质量分数为10%NaCl溶液50mL,制成匀浆。
(2)漏斗中放置滤纸或5层纱布过滤匀浆液,收集滤液。
(3)以4000r/min的离心速率离心滤液15min。注意使用同一规格的离心管,离心管内滤液的高度不超过离心管长度的2/3,离心前要确保在离心机中对称放置的离心管(内含滤液)的质量相等。(4)离心完毕后,果胶酶主要存在于离心管的上清液中,迅速地将上清液倒入洁净的小烧杯内,用0.1mol/L冰醋酸将pH调至3~4,在0~4℃下保存备用。
二、观察果胶酶对苹果匀浆液的作用
1、用榨汁机制作苹果匀浆液,将匀浆液置于90℃的恒温水浴中保温4min。冷却后再过滤,收集滤液。
2、取两支试管,编号为1和2,分别加入30mL滤液,再向试管1中加入30mL保存备用的上清液,向试管2中加入经过90℃水浴保温4min后的上清液30mL,振荡摇匀两支试管,置于室温下。
3、观察两支试管中苹果匀浆液的澄清程度变化,并将结果记录在下表中。
项目 |
苹果匀浆液/mL |
上清液/mL |
90℃水浴保温4min后的上清液/mL |
现象 |
澄清时间 |
试管1 (样品管) |
30 |
30 |
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试管2 (对照管) |
30 |
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30 |
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知识点拨:注意事项:
在温度、pH影响酶活性的实验中,始终都贯穿着对照原则,而在设置对照实验时最重要的是运用单一变量原则,其中的变量就是我们所研究的对象,所以在分析实验问题时,要紧紧抓住研究变量,把其他可能影响实验结果的变量变为常量,才能保证对照实验结果的严密性和准确性。对于温度对酶活性影响的关系曲线,在低于最适温度时,活性受温度影响比高于最适温度时的小。