生物技术药物与疫苗：

1、生物技术药物：
（1）概念：一般是指利用DNA重组技术或其他生物技术生产的药物。
（2）内容：包括基因工程药物、酶工程药物、发酵工程药物、细胞工程药物等。
2、基因工程药物
（1）生产过程：获得目的基因→构建基因工程菌→工程菌大规模培养→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检测→成品加工→成品检测。
（2）例子：大肠杆菌合成人胰岛素、干扰素等。
3、细胞工程药物
（1）制取过程：植物细胞株→固体培养→液体悬浮培养→收集细胞→提取纯化产物→药物制剂 。
（2）例子：人参、甘草、红豆杉、黄连、隐形、紫草和长春花等植物药物已经细胞培养成功；乙肝疫苗狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗等，以及干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等动物细胞培养药物。
4、生物技术疫苗：指基因工程疫苗。将病原体的某个或几个抗原基因转入适当的宿主细胞进行表达，获得的表达产物就可以作为疫苗使用。
5、DNA疫苗的应用前景广阔。
（1）DNA疫苗：又称核酸疫苗，是将致病微生物中，能够编码引起机体免疫反应的抗原基因与适当的载体结合，通过基因工程方法导入宿主细胞，并与宿主染色体整合，通过宿主细胞的转录、翻译表达出抗原，诱导宿主产生免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。
（2）DNA疫苗在某些肿瘤、艾滋病和肝炎等疾病的预防上可以发挥独特的作用。
知识拓展：

1、基因工程药物的生产中，最主要的环节是构建工程菌，即通过转基因技术将目的基因转入细菌中，形成基因重组工程菌。利用工程菌可以高效地生产出各种高质量、低成本的药品。
2、在动物细胞培养中，培养的细胞通常取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物。
3、生物技术疫苗的载体不仅可以是微生物、动物细胞，还可以是动物体和植物体。目前美国已经在14个州试种了300多种“制药”作物，如生产乙型肝炎疫苗的转基因药用西红柿、香蕉等。这种转基因植物为疫苗的接种和普及提供了方便。利用生物技术不仅可以生产抗原蛋白起到疫苗的作用，还可以利用生物技术敲除病原体中的某些致病基因，获得减毒更彻底、安全性更高的减毒活疫苗，如腺病毒疫苗等。

DNA重组技术的基本工具：

1、基因工程的概念：

基因工程的别名	基因拼接技术或DNA重组技术
操作环境	生物体外
操作对象	基因
操作水平	DNA分子水平
基本过程	剪切→拼接→导入→表达
结果	人类需要的基因产物

2、基本工具：
（1）“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
③结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
即 当限制性内切酶作用于特定的DNA时，把这段序列沿着特定的切点切开的这个过程分两种情况：
a、沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；
b、在中轴线的两端切口切开，得到的就是两个黏性末端。例如：EcoRⅠ限制性内切酶就可以识别G/AATTC的DNA序列，然后在G和A间切开，得到的就是两个黏性末端（之间可以根据碱基互补配对原则重组）限制酶的切口不都是一长一短的，一长一短的叫黏性末端，一样长的叫平末端。“粘性末端”在高中教材中也作“黏性末端”。如图：


（2）“分子缝合针”——DNA连接酶

种类	E·coli-DNA连接酶	T4-DNA连接酶
来源	大肠杆菌	T4噬菌体
功能特性	只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来	缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低
相同点	都缝合磷酸二酯键，如图：

 
（3）“分子运输车”——载体
①载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
②最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
③其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒

知识点拨：

1、限制酶识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。

2、获取目的基因和切割载体时使用同种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
3、获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生 4个黏性末端或平末端。
4、限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取
（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。
（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。
2、基因表达载体的构建
（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。如图：

①启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
②终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
（3）基因表达载体的构建过程：

3、将目的基因导入受体细胞
（1）转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
（2）常用的转化方法：

生物种类	植物细胞	动物细胞	微生物细胞
常用方法	农杆菌转化法	显微注射技术	Ca2+处理法
受体细胞	体细胞	受精卵	原核细胞
转化过程	将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达	将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物	Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子

（3）重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4、目的基因的检测和表达
（1）首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。
（2）其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原--抗体杂交。
（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

知识点拨：

1、构建基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。
2、PCR技术：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR扩增是获取目的基冈的一种非常有用的方法，也是进行分子鉴定和检测的一种很灵敏的方法。目的：通过指数式扩增获取大量的目的基因。
3、基因文库中不是直接保管相应基因，基因文库中的基因保存在受体菌中。
4、在基因工程的四个操作步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。
5、原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常用大肠杆菌等原核生物作为受俸细胞。
6、植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。
7、转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中，从而使受体生物获得了新的遗传特性的现象，从其变化的实质看，这种变异属于可遗传变异中的基因重组。
知识拓展：

1、基因文库的构建：
（1）概念
①基因组文库：含有一种生物的全部基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因组文库。
②cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因。
（2）构建过程

基因组文库的构建	cDNA文库的构建

2、人工合成目的基因
（1）反转录法：

（2）人工合成目的基因

3、PCR技术扩增目的基因
①原理：DNA双链复制
②过程：
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

单克隆抗体：

1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备
（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞
（2）获得杂交瘤细胞
①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；
②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测
（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖
（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取
3、单克隆抗体的应用
(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。


血清抗体与单克隆抗体的比较：

名称	产生	特点
血清抗体	由B淋巴	一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差
单克隆抗体	由杂交瘤细胞分泌	特异性强，灵敏度高，能大量制备

知识点拨：

1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：

制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。